水稻矮稈突變體及其回復(fù)體中Ds插入位點(diǎn)與轉(zhuǎn)座行為的分子分析.pdf

1、隨著水稻基因組全核苷酸序列測(cè)定工作的完成,功能基因組學(xué)研究已成為水稻分子生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。構(gòu)建突變體庫(kù)是研究水稻功能基因組學(xué)的一條重要途徑,常用的突變體庫(kù)構(gòu)建方法有物理和化學(xué)誘變、插入突變、基因沉默等。其中,利用 Ac/Ds系統(tǒng)構(gòu)建水稻突變體庫(kù)的方法得到了廣泛運(yùn)用。株高是水稻等糧食作物一個(gè)十分重要的農(nóng)藝性狀,直接影響到農(nóng)作物的豐產(chǎn)、耐肥和抗倒伏性能。本研究室經(jīng)過(guò)多年對(duì)粳稻品種Dongjin的Ac/Ds插入突變株系的栽培,從中篩選到一

2、株具有Ds插入且表型矮化的矮稈突變體(Dwarf mutant,DM),經(jīng)栽培后出現(xiàn)株高表型部分回復(fù)的回復(fù)突變體(Revertant type,RT)。本研究對(duì)該突變體及其回復(fù)體中Ds插入位點(diǎn)與轉(zhuǎn)座行為進(jìn)行了分子分析,取得了以下兩個(gè)方面的主要結(jié)果：
　?、鍖?duì)矮稈突變體進(jìn)行初步的表型鑒定。基于TAIL-PCR技術(shù)分離了矮稈突變體Ds插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列,并利用生物信息學(xué)手段,對(duì)Ds標(biāo)記基因及其編碼蛋白展開分子鑒定,結(jié)果顯示：⑴與野生型

3、(Wild-type,WT)相比,矮稈突變體表現(xiàn)為植株矮化,旗葉傾角擴(kuò)大,其平均株高45.9 cm(野生型79.0 cm),旗葉傾角75.6°(野生型25.3°)。⑵基于TAIL-PCR技術(shù),從矮稈突變體基因組DNA中分離克隆到Ds插入位點(diǎn)側(cè)翼序列,通過(guò) NCBI-BLAST在線分析顯示,Ds插入在水稻第3號(hào)染色體上(BAC克隆序列OSJNBa0054H04.28,登錄號(hào)AC106887.3)。⑶此Ds標(biāo)記基因包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子

4、,Ds插入在其第4外顯子上。該基因編碼產(chǎn)物為氧化還原酶,共有549個(gè)氨基酸殘基,從第401到第497個(gè)氨基酸是一個(gè)高度保守的2OG-Fe(II)氧化還原酶蛋白結(jié)構(gòu)域。⑷對(duì)該氧化還原酶進(jìn)行分析,BLASTP尋找同源蛋白,SWISS-MODEL分析此蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)此蛋白由9個(gè)α-螺旋和13個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)組成,與一些赤霉素氧化酶(GA3ox、GA20ox)具有相似的蛋白空間結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果表明,矮稈突變體(DM)矮化表型源于

5、Ds元件(4.6 kb)在氧化還原酶基因第4外顯子上的插入。經(jīng)過(guò)分析,推測(cè)此基因可能是一個(gè)新的編碼GA氧化酶的基因,通過(guò)影響GA的合成來(lái)維持水稻的正常株高。
　?、鎸?duì)矮稈突變體(DM)進(jìn)行栽培,后代出現(xiàn)株高表型部分回復(fù)的回復(fù)突變體(RT)。對(duì)回復(fù)突變體進(jìn)行表型鑒定,同時(shí),基于TAIL-PCR技術(shù)以及利用生物信息學(xué)手段,對(duì)其Ds轉(zhuǎn)座行為和新的插入位點(diǎn)展開分子鑒定,結(jié)果顯示：⑴回復(fù)突變體的平均株高74.1 cm(野生型79.0cm),

6、旗葉傾角44.1°(野生型25.3°),株高表型部分回復(fù)到正常。⑵Ds以“內(nèi)切酶模式”轉(zhuǎn)座機(jī)制在回復(fù)突變體的氧化還原酶基因上發(fā)生切離,并在Ds原初插入位點(diǎn)殘留序列為“CATCATGA”的8 bp轉(zhuǎn)座足跡。⑶利用生物信息學(xué)軟件FGENESH和GeneMark.hmm分析,發(fā)現(xiàn)8bp足跡殘留導(dǎo)致氧化還原酶基因第4外顯子被分隔為2個(gè)分別長(zhǎng)168和327 bp的外顯子,增加1個(gè)新的內(nèi)含子(長(zhǎng)83bp),且編碼產(chǎn)物減少為524個(gè)氨基酸殘基。利用軟

7、件DNAMAN和SWISS-MODEL分析發(fā)現(xiàn),8bp足跡殘留后的氧化還原酶在減少了部分無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的同時(shí)多出一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。⑷基于TAIL-PCR技術(shù),通過(guò)選用不同的簡(jiǎn)并引物,在回復(fù)突變體基因組中擴(kuò)增并分離到2條Ds轉(zhuǎn)座后新的插入側(cè)翼序列,定位在水稻第2號(hào)染色體(PAC克隆P0477B05,登錄號(hào)AP005310.3)和第6號(hào)染色體上(BAC克隆B1206D04,登錄號(hào)AP006616.2)。⑸第2號(hào)染色體上的Ds標(biāo)記基因由7個(gè)外顯子

8、和6個(gè)內(nèi)含子組成,推定其編碼產(chǎn)物為煙草胺氨基轉(zhuǎn)移酶;該酶含439個(gè)氨基酸殘基,從第64到第428個(gè)氨基酸,是一個(gè)高度保守的AAT蛋白結(jié)構(gòu)域,屬于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族。第6號(hào)染色體上的Ds標(biāo)記基因由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成,編碼衰老相關(guān)蛋白;該蛋白包含242個(gè)氨基酸殘基。以上結(jié)果表明,Ds從氧化還原酶基因上切離后,插入于水稻基因組第2、6號(hào)染色體上。其轉(zhuǎn)座行為不同于傳統(tǒng)的“剪切-粘貼”機(jī)制,表現(xiàn)出“剪切-復(fù)制-粘貼”的現(xiàn)象。經(jīng)分析,2個(gè)新