K域的亞域介導(dǎo)芥菜開花負(fù)調(diào)因子SVP與FLC同源和異源蛋白互作.pdf

1、開花是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換，是植物生命周期中的一個(gè)重要發(fā)育階段，它決定了植物能否完成有性繁殖。開花時(shí)間的早晚，決定了果實(shí)，種子等主要植物產(chǎn)品產(chǎn)量上市時(shí)間。因此植物開花的研究對(duì)于生產(chǎn)和育種具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。芥菜作為一種十分重要的十字花科類蔬菜作物，在我國(guó)各地都有著一定的種植面積。開花時(shí)間除了受光照（如日照強(qiáng)度，長(zhǎng)度）、溫度等外在環(huán)境的影響，還受植物生長(zhǎng)狀態(tài)、發(fā)育階段、遺傳因素等內(nèi)在條件影響。主要有自主途徑、春化途徑、光周期

2、途徑和赤霉素途徑四條途徑調(diào)控芥菜開花。雖然這四條途徑都有著各自的下游基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但最終都會(huì)匯集到開花整合子，完成開花調(diào)控。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些的與植物開花相關(guān)的基因，如FLOWERINGLOCUS T(FT), SUPPRESSOR OF CO OVEREXPRESSION1(SOC1),FLOWERINGLOCUS C(FLC)，SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)等，其中FT與SOC1促進(jìn)開花、FLC與SVP抑制開

3、花。
　　SVP基因最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，它是從早花型突變體中通過(guò)En-1轉(zhuǎn)座子第一個(gè)被確認(rèn)，位于第2條染色體上，具有抑制開花的作用。SVP蛋白屬典型的MIKC型蛋白，含有一個(gè)保守性較強(qiáng)的MADS域和K域，以及保守性稍弱的I域和C域。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)芥菜SVP基因編碼的蛋白也為MIKC型MADS域蛋白。FLC是一個(gè)關(guān)鍵的開花抑制基因，屬于MADS-box基因，其編碼的的蛋白質(zhì)屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明，芥

4、菜FLC與SVP蛋白相互作用，形成一個(gè)二聚復(fù)合物，對(duì)環(huán)境信號(hào)進(jìn)行共同介導(dǎo)，抑制下游開花整合子FT與SOC1的表達(dá)，進(jìn)而抑制植物開花。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LC與SVP互作域?yàn)镵域，但是K域可以分為K1，K2，K3三個(gè)亞域究竟是哪個(gè)亞域?qū)Φ鞍谆プ髌饹Q定性作用，目前仍不清楚。故本研究對(duì)芥菜FLC與SVP的互作亞域進(jìn)行了篩選。
　　1、芥菜FLC與SVP亞域的克隆及酵母載體的構(gòu)建
　　本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的芥菜酵母重組質(zhì)粒pGADT7-FLC

5、、pGADT7-SVP、pGBKT7-FLC、pGBKT7-SVP序列為參照，設(shè)計(jì)引物。分別亞克隆了芥菜SVP的全長(zhǎng)與7個(gè)截短體:BjSVP(MIKC)編碼241個(gè)氨基酸、BjSVP△1(I)編碼57個(gè)氨基酸、BjSVP△2(K)編碼78個(gè)氨基酸、BjSVP△3(IK)編碼111個(gè)氨基酸、BjSVP△4(IK1L1K2L2編碼86個(gè)氨基酸、BjSVP△5(IK1L1K2)編碼80個(gè)氨基酸、BjSVP△6(IK1L1)編碼64個(gè)氨基酸、B

6、jSVP△7(IK1)編碼52個(gè)氨基酸;以及FLC全長(zhǎng)與5個(gè)截短體:BjFLC(MIKC)編碼197個(gè)氨基酸、BjFLC△1(I)編碼57個(gè)氨基酸、BjFLC△2(K)編碼54個(gè)氨基酸、BjFLC△3(IK)編碼115個(gè)氨基酸、BjFLC△4(IK1K2)編碼108個(gè)氨基酸、BjFLC△5(IK1)編碼78個(gè)氨基酸。同時(shí)構(gòu)建各個(gè)片段的酵母雙雜交重組表達(dá)載體，分析由K域亞域介導(dǎo)的FLC與SVP異源、同源蛋白相互作用的亞域。
　　利用

7、同源重組技術(shù)，構(gòu)建了FLC與SVP各個(gè)截短體的酵母表達(dá)載體pGBKT7-BjFLC、pGBKT7-BjFLC△1～5、pGBKT7-BjSVP以及pGADT7-BjSVP、pGADT7-BjSVP△1～7、pGADT7-BjFLC。利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母中，得到酵母轉(zhuǎn)化子Y2Hgold[pGBKT7-BjFLC]、Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]、Y2Hgold[pGBKT7 BjFLC△1～5]和Y1

8、87[pGADT7 BjSVP]、Y187[pGADT7BjFLC]、Y187[pGADT7 BjSVP△1～7]。在毒性檢測(cè)中，轉(zhuǎn)入pGBKT7重組載體的轉(zhuǎn)化子經(jīng)SD/-Trp篩選發(fā)現(xiàn)各重組質(zhì)粒對(duì)Y2Hgold菌株無(wú)毒性，轉(zhuǎn)入pGADT7重組載體的轉(zhuǎn)化子經(jīng)SD/-Leu篩選發(fā)現(xiàn)各重組質(zhì)粒對(duì)Y187菌株無(wú)毒性。在自激活檢測(cè)中，轉(zhuǎn)入pGBKT7重組載體的轉(zhuǎn)化子經(jīng)SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Leu/-Trp(DD

9、O)、SD/-Trp/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基的逐層篩選發(fā)現(xiàn)各轉(zhuǎn)化子在Y2Hgold菌株中不存在自激活現(xiàn)象;轉(zhuǎn)入pGADT7重組載體的轉(zhuǎn)化子經(jīng)SD/-Leu、SD/-Leu/X-a-Gal、SD/-Leu/-Trp(DDO)、SD/-Leu/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基的逐層篩選發(fā)現(xiàn)各轉(zhuǎn)化子在Y187菌株中不存在自激活現(xiàn)象。
　　2、K域亞域介導(dǎo)的FLC與SVP異源蛋白相互作用
　　Y187[pGADT7-Bj SVP△

10、1～7]分別與Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]轉(zhuǎn)化菌落兩兩組合，融合酵母中Y187[pGADT7-BjSVP△2～7]×Y2HGold[pGBKT7-BjFLC]、Y187[pGADT7-BjSVP]×Y2HGold[pGBKT7-BjFLC]在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA（QDO/X-α-Gal/AbA）平板上可以長(zhǎng)出藍(lán)色菌落。由此推測(cè)在FLC與SVP的異源蛋白相互作用中，BjSVP蛋

11、白K域的K1亞域是該相互作用的結(jié)合域。β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)和方差分析表明:在異源蛋白相互作用過(guò)程中，BjSVP K蛋白中的K2亞域可以加強(qiáng)蛋白的相互作用，K3亞域和L1連接區(qū)對(duì)蛋白互作強(qiáng)度沒有影響，L2連接區(qū)對(duì)蛋白的相互作用具有削弱作用。
　　Y2HGold[pGBKT7-BjFLC△1～5]分別與Y187[pGADT7-BjSVP△7]兩兩融合，融合菌Y2HGold[pGBKT7-BjFLC]×Y187[pGADT7-BjSV

12、P△7]、Y2HGold[pGBKT7-BjFLC△2～5]×Y187[pGADT7-BjSVP△7]可以在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA(QDO/X-α-Gal/AbA)平板上長(zhǎng)出藍(lán)色菌落。由此推測(cè)在BjFLC蛋白中K域的K1亞域是該相互作用的結(jié)合域。β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)和方差分析表明:在異源蛋白相互作用過(guò)程中FLC蛋白K域中的K2亞域可增加作用強(qiáng)度，而K3亞域可減弱蛋白作用強(qiáng)度。
　　3

13、、K域亞域介導(dǎo)的SVP與FLC同源蛋白相互作用
　　在SVP與SVP同源蛋白互作域篩選實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)化子Y187[pGADT7-BjSVP△1～7]與轉(zhuǎn)化子Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]分別兩兩融合，融合菌V187[pGADT7-BjSVP△2]×Y2HGold[pGBKT7-BjSVP]、Y187[pGADT7-Bj SVP△3]×Y2HGold[pGBKT7-BjSVP]可以在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-Hi

14、s/X-α-Gal/AbA(QDO/X-α-Gal/AbA)平板上長(zhǎng)出藍(lán)色菌落。因此推測(cè)SVP同源蛋白相互作用中完整的K域(K1L1K2L2K3)是BjSVP自身互作所必須的，K域亞域的缺失會(huì)破壞自身蛋白的互作。
　　在FLC與FLC同源蛋白互作域篩選試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)化子Y2Hgold[pGBKT7-BjFLC△1～5]與轉(zhuǎn)化子Y187[pGADT7-FLC]兩兩融合，融合菌Y2Hgold[pGBKT7-FLC△2～5]×Y187[pG