芥菜AGL24基因的啟動(dòng)子克隆與其互作因子SOC1遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、芥菜(Brassica juncea Coss.)是一種著名的十字花科蕓薹屬蔬菜作物。研究芥菜的抽薹開(kāi)花及其調(diào)控機(jī)理，對(duì)于芥菜栽培生產(chǎn)和品種選育等研究有著重要的指導(dǎo)意義。近年來(lái)，在模式植物擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)了180多種與開(kāi)花調(diào)控相關(guān)的基因，它們被歸類(lèi)于6條開(kāi)花調(diào)控途徑，分別為：光周期途徑、春化途徑、溫敏途徑、年齡途徑、自主途徑和赤霉素途徑。開(kāi)花整合子（floral integrator）能夠整合不同途徑中的開(kāi)花信號(hào)，形成網(wǎng)絡(luò)通路，最終調(diào)

2、控抽薹與開(kāi)花時(shí)間。其中，SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)和AGAMOUS-LIKE24（AGL24）就是兩個(gè)重要的開(kāi)花信號(hào)整合子。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)SOC1和AGL24能形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán)，彼此正向調(diào)控對(duì)方的mRNA水平，促進(jìn)二者共同高水平表達(dá)，以調(diào)節(jié)開(kāi)花。在芥菜作物中，SOC1和AGL24之間是否也有這種調(diào)節(jié)機(jī)制，它們之間的調(diào)控模式如何，目前尚不清楚。
　　為了闡明芥菜SO

3、C1蛋白與AGL24基因相互作用機(jī)制，本研究重點(diǎn)檢測(cè)了SOC1蛋白是否能作為轉(zhuǎn)錄因子與AGL24啟動(dòng)子相互作用，并參與啟動(dòng)AGL24的表達(dá)。首先，根據(jù)已知的芥菜AGL24基因序列，通過(guò)染色體步移法克隆得到AGL24啟動(dòng)子序列。其次，構(gòu)建AGL24啟動(dòng)子截短體與SOC1酵母單雜交重組表達(dá)載體，通過(guò)酵母單雜檢測(cè)了相互作用及其作用區(qū)域。最后，還獲得了SOC1正反義轉(zhuǎn)基因芥菜體系。意在為以后深入研究SOC1蛋白對(duì)AGL24基因的表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)

4、。試驗(yàn)結(jié)果詳述如下：
　　1、芥菜AGL24啟動(dòng)子的克隆與生物信息學(xué)分析
　　提取芥菜基因組DNA，根據(jù)已知的AGL24基因序列，設(shè)計(jì)染色體步移法中3個(gè)特異性引物，巢式PCR擴(kuò)增得到AGL24的5’端啟動(dòng)子區(qū)域3020bp，經(jīng)NCBI序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)為芥菜AGL24基因5’端啟動(dòng)子序列。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)到啟動(dòng)子核心調(diào)控元件TATA-box、CAAT-box等共193個(gè)調(diào)控元件。分析啟動(dòng)子序列上CArG-box基序，發(fā)現(xiàn)了

5、16個(gè)類(lèi)似CArG-box的結(jié)構(gòu)。說(shuō)明其在開(kāi)花調(diào)控中可能受到多個(gè)MADS-box類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，這與其整合子的特質(zhì)名符其實(shí)，但與哪些MADS-box類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用，需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步研究。
　　2、AGL24啟動(dòng)子截短體與SOC1蛋白的酵母單雜交試驗(yàn)
　　為進(jìn)一步鑒定芥菜SOC1蛋白與AGL24啟動(dòng)子的相互作用，對(duì)AGL24啟動(dòng)子上CArG-box序列進(jìn)行分析后，將其亞克隆為含有完整CArG-box序列的3個(gè)截短體（

6、簡(jiǎn)稱(chēng)為AGL24A、AGL24B和AGL24C），其長(zhǎng)度分別為923bp、902bp和1096bp，并構(gòu)建相應(yīng)的酵母誘餌表達(dá)載體（pAbAi-AGL24A、pAbAi-AGL24B、pAbAi-AGL24C）。同時(shí)，亞克隆SOC1基因，構(gòu)建含SOC1的酵母蛋白表達(dá)載體pGADT7-SOC1。PCR檢測(cè)、雙酶切及測(cè)序表明，兩種酵母單雜重組載體構(gòu)建成功。
　　再依據(jù)酵母單雜交操作手冊(cè)，將pAbAi-AGL24A、pAbAi-AGL24

7、B、pAbAi-AGL24C分別線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)入Y1H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞，得到酵母誘餌受體菌株Y1H[pAbAi-AGL24A]、Y1H[pAbAi-AGL24B]、Y1H[pAbAi-AGL24C]。AbA背景濃度抗性篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在SD/-Ura培養(yǎng)基中添加350ng/ml的AbA，能有效抑制上述單轉(zhuǎn)化子菌株的生長(zhǎng)。因此，后續(xù)試驗(yàn)選用350ng/ml的AbA作為最適背景抑菌濃度。進(jìn)一步將含SOC1的酵母蛋白表達(dá)載體pGADT7-S

8、OC1分別轉(zhuǎn)入Y1H[pAbAi-AGL24A]、Y1H[pAbAi-AGL24B]、Y1H[pAbAi-AGL24C]的酵母感受態(tài)細(xì)胞中，獲得可表達(dá)SOC1蛋白及AGL24截短體的共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y1H[SOC1+AGL24A]、Y1H[SOC1+AGL24B]和Y1H[SOC1+AGL24C]，PCR檢測(cè)正確后，涂布在含350ng/ml AbA的SD/-Leu缺素培養(yǎng)基（SD/-Leu+AbA350）30℃倒置培養(yǎng)5~7天。并以Y1H

9、[p53-AbAi+ pGADT7-53]作陽(yáng)性對(duì)照，以Y1H[pAbAi-AGL24A+pGADT7]作陰性對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Y1H[SOC1+AGL24B]能在缺素培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)；而Y1H[SOC1+AGL24A]和Y1H[SOC1+AGL24C]均不能生長(zhǎng)。由此酵母單雜交試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，芥菜AGL24啟動(dòng)子序列中間的截短體AGL24B能與SOC1蛋白發(fā)生相互作用。
　　3、芥菜SOC1正反義載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
　　根據(jù)芥

10、菜SOC1基因序列，設(shè)計(jì)上下游均含BamH I酶切位點(diǎn)的引物組合，從芥菜cDNA中亞克隆SOC1，并分別正向和反向插入pBI121。通過(guò)PCR篩選，獲得正義和反義表達(dá)載體（分別記為pBI121-SOC1和pBI121-soc1）。以pBI121空載為陰性對(duì)照，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將SOC1的正反義表達(dá)載體pBI121-SOC1和pBI121-soc1轉(zhuǎn)化芥菜下胚軸，并分化增殖。通過(guò)抗性篩選和PCR目的基因篩查后，獲得SOC1轉(zhuǎn)基因芥菜植株正