靶向豬CLTC基因的miRNA對(duì)乙腦病毒侵入PK15細(xì)胞作用的研究.pdf

1、乙型腦膜炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）為蟲媒病毒，屬于黃病毒科。能夠在世界范圍內(nèi)引起嚴(yán)重的急性腦膜炎疾病。豬是乙型腦膜炎病毒的貯存宿主，豬-蚊-豬，豬-蚊-人的循環(huán)傳播嚴(yán)重威脅著人類的健康，同時(shí)乙型腦炎病毒還可以造成母豬的流產(chǎn)或者死胎以及公豬的睪丸炎疾病，對(duì)畜牧業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。microRNA是一類內(nèi)源性的長度約20-23nt的一類非編碼RNA，在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，越來越

2、多的研究表明，宿主miRNA具有抗病毒感染的作用。不同的病毒侵入不同的細(xì)胞需要不同的入胞途徑，其中，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的包吞途徑研究的較為清楚，網(wǎng)格蛋白最基本的亞單位是由三個(gè)重鏈和三個(gè)輕鏈組成，相關(guān)研究報(bào)道，乙型腦炎病毒通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑侵入豬腎上皮細(xì)胞系PK15，所以本項(xiàng)目擬以豬CLTC基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控為切入點(diǎn)，鑒定靶向豬CLTC基因的miRNA，并探究miRNA-clathrin包被小窩通路在乙型腦膜炎病毒侵入PK15細(xì)胞中的作用

3、機(jī)制。
　　本研究通過生物信息學(xué)的方法初步篩選出靶向豬CLTC基因的6條ssc-miRNA mimics，并進(jìn)一步使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒，Western Blot技術(shù)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法驗(yàn)證出靶向豬CLTC基因的ssc-miRNA mimics，試驗(yàn)將miRNA與豬CLTC基因的配對(duì)堿基突變作為陰性對(duì)照，明確證實(shí)了靶向豬CLTC基因的ssc-miRNA mimics，并進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA與豬CLTC基因的靶向機(jī)理。采

4、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)靶向豬CLTC基因的miRNA對(duì)乙型腦膜炎病毒侵入豬PK15細(xì)胞的影響。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)敲低CLTC基因表達(dá)后對(duì)乙型腦膜炎病毒侵入豬PK15細(xì)胞的影響。最后，乙型腦膜炎病毒感染豬PK15細(xì)胞以后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法探索不同時(shí)間點(diǎn)miRNA和其靶基因CLTC的表達(dá)變化規(guī)律。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明：實(shí)時(shí)熒光定量PCR，Western Blot技術(shù)以及雙熒光素酶檢測(cè)試驗(yàn)相結(jié)合，驗(yàn)證

5、了靶向豬CLTC基因的2條miRNA mimics，分別是：ssc-miR-1和ssc-miR-129-5p；利用點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)證實(shí)ssc-miR-1和ssc-miR-129-5p能夠靶向豬CLTC基因，且ssc-miR-1通過堿基配對(duì)與豬CLTC基因互補(bǔ)結(jié)合，完全遵循“種子規(guī)則”。而ssc-miR-129-5p抑制豬CLTC基因的表達(dá)沒有遵循“種子規(guī)則”，不具有物種保守性；定量檢測(cè)結(jié)果表明，靶向豬CLTC基因的miR-1和miR-129-