慢病毒介導的miRNA-302c對腹膜間皮細胞EMT的干預作用及機制研究.pdf

1、慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一，國內(nèi)外發(fā)病率逐年上升。約5％的CKD患者最終將發(fā)展成終末期腎功能衰竭，需終身接受腎臟替代治療。其中，腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是符合我國國情的主要腎臟替代治療方法，但長期PD可引起腹膜纖維化，導致超濾衰竭(ultrafiltration failure，UFF)，進而影響PD的長期應用，是患者退出PD的主要原因。

2、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是腹膜纖維化發(fā)病機制中的關(guān)鍵因素，近年來多項研究發(fā)現(xiàn)腹膜間皮細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在TGF-β誘導的腹膜纖維化中起重要作用，是腹膜纖維化啟動和可逆的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)具有促進細胞增殖、遷移和分

3、化等作用，研究證實CTGF通過介導TGF-β1，或直接作用其下游信號分子，與許多組織器官纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，CTGF不僅在PD腹膜纖維化中起到關(guān)鍵作用，并且在纖維化的始動過程EMT的發(fā)生中也起到重要促進作用。
　　microRNAs(miRNA)屬于功能性非編碼RNA，通過降解目標mRNA或抑制其翻譯調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達，參與調(diào)控生長發(fā)育，細胞分化、增殖、凋亡，腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展，是目前生命科學領域的研究

4、熱點。有研究證實miRNA是TGF-β1誘導EMT的重要調(diào)節(jié)因子，如miRNA-200家族和miRNA-205。但是，miRNA在腹膜纖維化領域的研究尚未見文獻報道。近期，我們采用高通道m(xù)iRNA芯片技術(shù)對PD病人腹透流出液腹膜間皮細胞miRNA的表達進行了圖譜分析，發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達與PD患者腹膜EMT及纖維化密切相關(guān)。
　　隨著基因治療技術(shù)及基因載體系統(tǒng)的發(fā)展，對于PD患者腹膜纖維化的分子機制和干預治療研究取得了進一步的

5、發(fā)展，大量在PD的動物模型中進行的基因治療研究證實了基因治療方法在腹膜纖維化機制研究和治療中的可行性。慢病毒載體(lentiviral vector，LV)作為目前被廣泛應用的基因載體，具有轉(zhuǎn)染效率高，插入外源基因容量大，能感染分裂期和非分裂期細胞，并且不會引起明顯免疫和炎癥反應等優(yōu)勢，將其應用于腹膜纖維化的研究十分有意義。
　　基于以上分析，我們認為某些miRNA可參與調(diào)節(jié)腹膜間皮細胞EMT，以慢病毒載體為基因轉(zhuǎn)染工具，從miR

6、NA著手研究其在PD過程中EMT及纖維化的作用及分子機制具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　第一章腹腔注射慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠腹膜間皮細胞效應的研究
　　目的：通過小鼠腹腔注射不同滴度的攜帶綠色熒光蛋白(greenfluorescence protein，GFP)基因的慢病毒，觀察其轉(zhuǎn)染小鼠腹膜間皮細胞的效應，探討腹腔注射慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠腹膜間皮細胞最佳效應滴度。
　　方法12周齡ICR雄性小鼠，體重28-30克。隨機分為對照組(

7、n=5)、LV-GFP1組(n=5)、LV-GFP2組(n=5)、LV-GFP3組(n=5)。分別一次腹腔注射1.5ml0.9％生理鹽水或者不同滴度的慢病毒。于第28天處死小鼠，壁層腹膜用于HE和Masson染色觀察腹膜形態(tài)變化、冰凍切片觀察GFP表達，臟層腹膜用于提取組織mRNA和蛋白，采用Real Time PCR和Western blot方法檢測GFP mRNA和蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1.倒置熒光顯微鏡觀察小鼠腹

8、膜組織冰凍切片，與對照組相比，腹腔注射慢病毒小鼠腹膜組織有GFP表達;
　　2.小鼠腹膜組織石蠟切片HE、Masson染色觀察(.)與對照組相比，腹腔注射慢病毒小鼠腹膜組織形態(tài)學無明顯改變;
　　3.Real Time PCR和western blot的方法檢測，腹腔注射慢病毒小鼠腹膜組織有GFP mRNA和蛋白表達;
　　4.使用2×108GTU LV-GFP組的轉(zhuǎn)染效率高于()108GTU LV-GFP組，而與3×

9、108GTU LV-GFP組轉(zhuǎn)染效率差異不大。
　　結(jié)論：
　　腹腔注射慢病毒能安全有效轉(zhuǎn)染小鼠腹膜組織，2×108GTU為最佳效應滴度。
　　第二章miRNA-302c在腹膜透析小鼠腹膜間皮細胞EMT中的作用與機制
　　目的：利用慢病毒載體將miRNA-302c導入PD小鼠腹膜組織，研究miRNA-302c在PD小鼠腹膜間皮細胞EMT中的作用與機制。
　　方法：12周齡ICR雄性小鼠，體重28-30克。隨

10、機分為空白對照組(n=5):腹腔注射1.5ml0.9％生理鹽水，每天一次×28天;PDF組(n=5):腹腔注射1.5ml含4.25％葡萄糖的標準腹透液，每天一次×28天;LV-mmu-miRNA-302c+PDF組(n=5):腹腔注射1.5ml含2×108GTU的LV-mmu-miRNA-302c，第三天開始腹腔注射1.5ml含4.25％葡萄糖的標準腹膜透析液，每天一次×28天;LV-pGIPZ+PDF組:腹腔注射1.5ml含2×108

11、GTU的LV-pGIPZ，第三天開始腹腔注射1.5ml含4.25％葡萄糖的標準腹膜透析液，每天一次×28天。于第28天處死小鼠，壁層腹膜用于制作石蠟切片HE和Masson染色觀察腹膜形態(tài)變化、冰凍切片觀察GFP表達，臟層腹膜用于提取組織蛋白和mRNA，并采用Weste(rn)-blot、Real Time-PCR等方法檢測miRNA-302c、E-cadherin、α-SMA、collagenⅠ、CTGF的表達。
　　結(jié)果：

12、>　　1.小鼠腹膜組織石蠟切片HE、Masson染色觀察，與空白對照組相比，PDF組小鼠腹膜組織可見EMT的形態(tài)變化，而LV-mmu-miR-302c+PDF組腹膜組織形態(tài)學變化介于空白對照組和PDF組之間，EMT改變較PDF組減輕;
　　2.TaqMan探針實時熒光定量Real Time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，腹腔注射4.25％PDF的各組小鼠臟層腹膜組織miRNA-302c表達均有下調(diào)，LV-mmu-miR-302

13、c+PDF組較PDF組miRNA-302c表達增高;
　　3.Real Time PCR、western blot證實每天腹腔注射4.25％PDF1.5ml，連續(xù)28天，可引起小鼠腹膜組織EMT，E-cadherin表達減少，α-SMA及collagenⅠ表達增高。而LV-mmu-miR-302c轉(zhuǎn)染上調(diào)miRNA-302c可抑制腹透小鼠腹膜組織α-SMA、collagenⅠ表達增加，E-cadherin表達降低;與空白對照組相比

14、，各組腹透小鼠腹膜組織CTGF表達均有上調(diào)，LV-mmu-miR-302c+PDF組較PDF組CTGF表達降低。
　　結(jié)論：
　　高糖腹透液可引起小鼠腹膜間皮細胞EMT; LV-(m)mu-miR-302c可有效轉(zhuǎn)染小鼠腹膜上調(diào)miRNA-302c的表達，抑制CTGF表達，減輕腹透小鼠腹膜間皮細胞EMT。
　　第三章 miRNA-302c調(diào)控TGF-β1誘導的腹膜間皮細胞EMT形成的機理
　　目的：通過觀察慢病毒

15、介導的miRNA-302c對TGF-β1誘導人腹膜間皮細胞(human peritoneal mesothelial cells，HPMCs) EMT過程中CTGF表達的影響，探討miRNA-302c調(diào)控TGF-β1誘導的HPMCsEMT形成的機制。
　　方法：常規(guī)培養(yǎng)正常HPMCs，隨機分為:空白對照組:不加任何干預;TGF-β1組:用5ng/mlTGF-β1刺激48小時;LV-hsa-miR-302c+TGF-β1組:轉(zhuǎn)染載有

16、miRNA-302c的慢病毒LV-hsa-miR-302c后，用5ng/mlTGF-β1刺激48小時;LV-pGIPZ+TGF-β1組:轉(zhuǎn)染載有對照質(zhì)粒pGIPZ的慢病毒LV-pGIPZ后，用5ng/mlTGF-β1刺激48小時。采用熒光顯微鏡觀察GFP熒光蛋白表達以判斷病毒轉(zhuǎn)染效率。采用Western-blot、Real Time-PCR等方法分別檢測miRNA-302c、E-cadherin、α-SMA、collagenⅠ、CTGF

17、等在HPMCs中的表達變化及其相互關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.TaqMan探針實時熒光定量Real Time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，TGF-β1刺激的各組腹膜間皮細胞miRNA-302c表達均有下調(diào)，LV-hsa-miR-302c+TGF-β1組miRNA-302c表達較TGF-β1組增高;
　　2.HPMCs經(jīng)5ng/ml TGF-β1刺激48小時后，細胞出現(xiàn)成纖維樣細胞形態(tài)改變，而LV-hsa-miR-

18、302c+TGF-β1組細胞形態(tài)變化介于空(白)對照組和TGF-β1組之間，細胞EMT形態(tài)改變較TGF-β1組減輕;
　　3.Real TimePCR、western blot證實5ng/ml TGF-β1刺激48h可引起HPMCsEMT，E-cadherin表達減少，α-SMA及collagenⅠ表達增高;而LV-hsa-miR-302c轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-302c可抑制TGF-β1誘導的α-SMA、collagenⅠ表達增加，E-