豬AOPBEC3F在PK15細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)及其對(duì)PERV的突變抑制作用研究.pdf

1、載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白(apolipoprotein BmRNA editing enzyme，catalytic polypeptide，APOBEC)是一種機(jī)體固有免疫抗病毒因子，其主要的生物學(xué)功能除涉及脂類代謝、抗體多樣化外，最重要的是對(duì)許多內(nèi)源性及外源性反轉(zhuǎn)錄病毒、反轉(zhuǎn)座子和一些DNA病毒具有抑制作用。APOBEC分子已被證實(shí)能夠有效阻抑HIV-1、HBV、MLV及PERV等病毒的復(fù)制，其對(duì)病毒的抑制主要依賴其

2、胞苷脫氨酶機(jī)制，即通過(guò)被包裝進(jìn)入病毒粒子并于靶細(xì)胞內(nèi)釋放，于病毒反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中催化病毒cDNA第一鏈胞嘧啶發(fā)生脫氨基作用，使病毒cDNA負(fù)鏈發(fā)生廣泛的dC→dU超突變(正鏈為G→A)，導(dǎo)致病毒無(wú)法正常復(fù)制或無(wú)法組裝。APOBEC分子作為參與機(jī)體固有免疫因子的重要一員，其新穎的抗病毒機(jī)制已逐漸成為研究熱點(diǎn)。
　　 將豬細(xì)胞、組織及器官應(yīng)用于豬→人異種移植被認(rèn)為是解決人類器官移植捐獻(xiàn)短缺問(wèn)題的重要途徑之一。然而，豬體內(nèi)天然含有的豬內(nèi)源

3、性反轉(zhuǎn)錄病毒(Porcine endogenous retrovirus，PERV)成為豬→人異種移植的主要障礙，它被證實(shí)能夠感染人源細(xì)胞并可能導(dǎo)致受體罹患免疫缺陷性疾病。鑒于PERV感染異種移植受體后存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，許多降低或消除該風(fēng)險(xiǎn)的策略被陸續(xù)提出與嘗試，但效果都不夠理想且代價(jià)較高。豬體內(nèi)天然含有一種APOBEC分子即豬APOBEC3F，已被證實(shí)對(duì)HIV-1、MLV等病毒亦存在抑制作用，而其是否能抑制PERV復(fù)制尚無(wú)定論。若能實(shí)現(xiàn)以

4、豬自身免疫機(jī)制清除PERV或?qū)⑵涞味瓤刂圃跇O低的范圍這一目標(biāo)，那么PERV在異種器官移植中的潛在風(fēng)險(xiǎn)就能夠得到有效控制。為此，本研究對(duì)豬APOBEC3F是否能夠抑制PERV的復(fù)制及其可能機(jī)制進(jìn)行了探討，主要工作包括一下幾個(gè)方面：
　　 首先，利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建了攜帶豬APOBEC3F基因的重組質(zhì)粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP，并將該重組質(zhì)粒與pVSV-G、pGag-Pol共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293T包裝出假型病毒，然

5、后用該病毒感染PK15細(xì)胞；成功感染后經(jīng)G418加壓篩選，最終獲得穩(wěn)定表達(dá)豬APOBEC3F的PK15細(xì)胞株，通過(guò)PCR、Western blot能夠在該細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到豬APOBEC3F基因的整合和蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究豬APOBEC3F對(duì)PERV的抑制作用建立了研究模型。
　　 其次，采用相對(duì)熒光定量PCR對(duì)穩(wěn)定表達(dá)豬APOBEC3F的PK15細(xì)胞中的PERV mRNA進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PERV mRNA拷貝數(shù)僅為正常水平的

6、31%；另一方面，設(shè)計(jì)靶向沉默豬APOBEC3F的siRNA載體并實(shí)現(xiàn)對(duì)該基因的沉默，通過(guò)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)PERV在豬APOBEC3F沉默的情況下拷貝數(shù)為對(duì)照的6倍左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，豬APOBEC3F對(duì)PERV存在抑制。
　　 最后，通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了豬APOBEC3F與PERV-Gag存在相互作用，而Western blot檢測(cè)證實(shí)了PERV對(duì)豬APOBEC3F實(shí)現(xiàn)了包裝；與此同時(shí)，分析穩(wěn)定表達(dá)豬APOBEC3F

7、的PK15細(xì)胞的PERV基因組序列發(fā)現(xiàn)，PERV在豬APOBEC3F持續(xù)表達(dá)條件下發(fā)生了G→A的突變，以上結(jié)果提示豬APOBEC3F很可能由PERV-Gag引導(dǎo)被包裝入病毒粒子，最終通過(guò)胞苷脫氨作用對(duì)PERV產(chǎn)生抑制。
　　 綜上所述，本研究證實(shí)了豬APOBEC3F具有抗PERV復(fù)制作用，而PERV基因組的G→A突變提示了豬APOBEC3F很可能通過(guò)胞苷脫氨機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)PERV的抑制。本研究為進(jìn)一步深入研究豬APOBEC3F抑制P