晝夜溫差對(duì)鐵皮石斛原球莖多糖含量的影響及機(jī)理研究.pdf

1、鐵皮石斛（Dendrobium officinale），是蘭科石斛屬藥用植物，有著非常獨(dú)特的價(jià)值。本研究以鐵皮石斛原球莖為材料，探討了有利于原球莖增殖、保存及多糖積累的最佳培養(yǎng)條件，并初步建立液體培養(yǎng)系，以測(cè)定其在不同晝夜溫差下的多糖含量，在此基礎(chǔ)上克隆了多糖合成途徑中的2個(gè)關(guān)鍵的糖基轉(zhuǎn)移酶基因—DoGAUT1和DoPGSIP6基因，并對(duì)該基因在不同晝夜溫差下進(jìn)行定量表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下：
　　1.鐵皮石斛離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2、
　　選取鐵皮石斛的原球莖為材料，優(yōu)化鐵皮石斛原球莖增殖與保存的離體培養(yǎng)條件。①采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，比較了6-BA、椰乳、土豆配合使用對(duì)原球莖增殖的影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出1/2 MS+土豆泥50 g/L較適合鐵皮石斛原球莖增殖，添加2.0 mg/L6-BA后，原球莖鮮重增殖系數(shù)增高，但原球莖部分分化。②改變1/2 MS中KNO3、KH2PO4的比例，比較其對(duì)鐵皮石斛原球莖增殖的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)KNO3，KH2PO4分別為對(duì)照的0

3、.5倍，1倍時(shí)，鐵皮石斛原球莖增殖系數(shù)雖最高，但原球莖少量黃化，對(duì)照1/2 MS較適合鐵皮石斛原球莖增殖。③對(duì)比不同的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮配比對(duì)鐵皮石斛原球莖增殖效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)KNO3，NH4NO3均為對(duì)照的0.5倍且土豆泥為50 g/L的培養(yǎng)基和1/2 MS+土豆泥50 g/L增殖系數(shù)相最高。④比較不同濃度的姜黃素和甜菜紅苷對(duì)鐵皮石斛原球莖離體保存的效果的影響，結(jié)果顯示姜黃素為0.1-1.0 g/L可以抑制原球莖生長，甜菜紅苷

4、濃度為0.1 g/L保存效果最好。⑤以誘導(dǎo)出的鐵皮石斛原球莖為材料，接種1/2 MS+土豆提取液50 g/L的液體培養(yǎng)基中，比較了不同時(shí)間下鐵皮石斛培養(yǎng)物生物量的變化，試驗(yàn)結(jié)果表明，在整個(gè)生育期內(nèi)，原球莖的鮮重變化曲線為S型，30-40 d快速生長。
　　2.鐵皮石斛離體培養(yǎng)物在不同晝夜溫差處理?xiàng)l件下多糖含量變化
　　以誘導(dǎo)出的鐵皮石斛原球莖為材料，比較了不同時(shí)間下鐵皮石斛培養(yǎng)物多糖的變化，在整個(gè)生長周期，原球莖多糖變化曲線

5、呈S型。選取培育30 d的鐵皮石斛原球莖為材料，對(duì)比了鐵皮石斛多糖含量在不同晝夜溫差下的差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，處理溫度為25℃/10℃，處理2 d的多糖含量最高，且在一定的處理時(shí)間范圍內(nèi)，多糖含量先增加后下降的趨勢(shì)；處理溫度為25℃/15℃，該溫度下多糖的含量隨著處理時(shí)間的增加而增加，該溫差是最適合促進(jìn)次生代謝物多糖積累的溫度；處理溫度為25℃/20℃，多糖含量呈遞增趨勢(shì)，略低于相同時(shí)間下溫度為25℃/15℃的處理。
　　3.鐵皮石

6、斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　應(yīng)用同源克隆與RACE技術(shù)結(jié)合，以鐵皮石斛原球莖為材料，克隆了兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因DoGAUT1和DoPGSIP6，全長分別為2518、2010 bp，分別編碼了705、549個(gè)氨基酸，登入號(hào)為1740985。生物信息學(xué)研究表明，DoGAUT1為親水性跨膜蛋白，不含信號(hào)肽，形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位于高爾基體。DoPGSIP6為疏水性跨膜蛋白，含信號(hào)肽，無卷曲

7、螺旋結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位于質(zhì)膜。它們同屬于GT8家族中的GT-A類的糖基轉(zhuǎn)移酶，DoGAUT1蛋白在第394-692位含有典型的GT8_like_1未知功能的保守結(jié)構(gòu)域，多個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)、2個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。而DoPGSIP6蛋白在第29-276位含有GT8_Glycogenin保守結(jié)構(gòu)域，多個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)、2個(gè)錳結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)保守基因序列DXD，該基序主要負(fù)責(zé)將不同的糖添加到糖鏈、碳酸鹽、蛋白上。此外，DoPGSIP6蛋白在第448-5

8、22位含有CCC1_like保守結(jié)構(gòu)域，它可能具有固氮的作用。進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建時(shí)發(fā)現(xiàn)DoGAUT1和DoPGSIP6基因推定的氨基酸序列分別與二穗短柄草，大豆進(jìn)化關(guān)系最近，而與番茄、甜橙親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　4.鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6基因在不同晝夜溫差下的定量表達(dá)分析
　　以18S rRNA為內(nèi)參基因，對(duì)DoGAUT1基因和DoPGSIP6基因在不同晝夜溫差下的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，晝夜溫度為