多胺促進(jìn)霍山石斛類原球莖芽發(fā)生及作用機(jī)理的研究.pdf

1、霍山石斛是我國名貴的食用藥用植物，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳、清音明目的保健功效。由于霍山石斛野生資源缺乏，人工栽培困難，組培苗繁殖系數(shù)低并殘留外源激素，因此在數(shù)量上及安全上不能滿足醫(yī)藥和功能食品開發(fā)的需求。本文對霍山石斛無外源激素殘留高效繁殖體系建立，及其生理生化與分子機(jī)理進(jìn)行了研究，以期為含有霍山石斛醫(yī)藥及保健功能產(chǎn)品的加工生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。
　　 本文取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1、對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過

2、程中內(nèi)源多胺含量進(jìn)行檢測，表明多胺可能是類原球莖芽發(fā)生的促進(jìn)因子。在芽發(fā)生過程中內(nèi)源亞精胺(Spermidine，Spd)和腐胺(Putrescine，Put)的含量顯著提高，總內(nèi)源多胺水平與芽發(fā)生呈正相關(guān)。多胺生物合成抑制劑MGBG(Mmethylglyoxal(bis)-guanylhydrazone)和DFMO(α-Difluoromethylomithine)可完全抑制類原球莖的芽發(fā)生。
　　 2、以霍山石斛類原球莖為實(shí)

3、驗(yàn)材料，對外源添加的多胺種類及濃度進(jìn)行篩選，建立了無外源激素的高效芽發(fā)生的培養(yǎng)體系。其中在MS培養(yǎng)基中外源添加2.0 mmol/L的Spd或Put對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生的促進(jìn)作用最為顯著。外源多胺可以通過增加內(nèi)源多胺的水平，解除多胺生物合成抑制劑MGBG和DFMO對類原球莖芽發(fā)生的抑制作用。
　　 3、內(nèi)源激素水平分析表明，外源多胺可顯著提高內(nèi)源細(xì)胞分裂素(Cytokinins，CTKs)水平，降低內(nèi)源生長素吲哚乙酸(Indo

4、le acetic acid，IAA)水平，因此導(dǎo)致總CTKs/IAA比值升高，促進(jìn)芽的發(fā)生。內(nèi)源激素代謝相關(guān)酶活性分析表明，外源多胺對內(nèi)源激素水平的改變與上調(diào)吲哚乙酸氧化酶(IAA oxdiase，IAAox)活性，下調(diào)細(xì)胞分裂素氧化酶(Cytokinin oxdiase，CKX)活性相關(guān)。在芽發(fā)生的第21 d，外源多胺Spd組、Put組CTKs分別是對照的1.7倍、2.2倍，IAA水平分別是對照的1.4倍和1.9倍，CTKs/IAA

5、分別是對照的2.4倍和4.6倍。多胺生物合成抑制劑MGBG和DFMO可抑制類原球莖芽發(fā)生過程中內(nèi)源激素水平和相關(guān)代謝酶活性的改變，補(bǔ)充外源多胺可以部分恢復(fù)內(nèi)源激素水平和相關(guān)代謝酶活性。
　　 4、細(xì)胞內(nèi)過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)水平分析表明，H2O2可能參與了外源多胺促進(jìn)的芽發(fā)生作用。外源多胺作用5 d時(shí)，多胺組中H2O2含量高達(dá)對照組的175.6％(Spd)、和180.6％(Put)；相關(guān)H2O2

6、產(chǎn)生酶--多胺氧化酶(Polyamine oxidase，PAO)活性顯著升高。H2O2淬滅劑二甲基硫脲(Dimethylthiourea，DMTU)對類原球莖芽發(fā)生具有抑制作用，補(bǔ)充外源多胺(Spd或Put)可以使該抑制作用部分解除。
　　 5、采用RT-PCR.和快速擴(kuò)增cDNA末端方法(RACE)克隆出霍山石斛CKX基因(DhCKX)cDNA全長序列。該序列含有一個(gè)編碼537個(gè)氨基酸的開放閱讀框，預(yù)測分子量為60.383k