鐵皮石斛多糖對高糖狀態(tài)下HCEC增殖、凋亡及AR、LN表達(dá)的影響.pdf

1、目的：觀察鐵皮石斛多糖（Polysaccharide of dendrobium candidum，PDC）及高糖對體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞（Human corneal epithelial cells，HCEC）增殖、凋亡及醛糖還原酶（Aldose Reductase，AR）、層粘連蛋白（Laminin，LN）的影響，探討鐵皮石斛多糖對糖尿病角膜上皮病變的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　1.篩選最適高糖濃度及處理時(shí)間：本次實(shí)驗(yàn)

2、的細(xì)胞模型為HCEC，在低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)HCEC細(xì)胞，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，劃定葡萄糖濃度篩選范圍，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：分別采用不同濃度（5.5mmol/l-50mmol/l）梯度的葡萄糖處理HCEC12h、24h、48h、72h，MTT法測定細(xì)胞存活率，統(tǒng)計(jì)分析后，確定最適糖濃度及處理時(shí)間。
　　2.篩選最佳PDC濃度及處理時(shí)間：取1中所得到的最適糖濃度和作用時(shí)間。同時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的PDC干預(yù)濃度，分別添加不同劑量（100，200，

3、400μg/ml）的PDC，培養(yǎng)12h、24h、48h、72h，MTT法測定細(xì)胞存活率，統(tǒng)計(jì)分析后，確定最佳PDC濃度及處理時(shí)間。
　　3.取1，2中所得到的高糖濃度、PDC濃度及作用時(shí)間，設(shè)置4組，即對照組（C）、高糖組（HG）、PDC組及HG+PDC組，觀察并比較它們對HCEC遷移、增殖、凋亡及AR、LN的表達(dá)的影響。
　?。?）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力
　　（2）MTT法測定細(xì)胞增殖活性
　?。?）An

4、nexin V-FITC/PI雙熒光染色法+流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，RT-qPCR檢測bax mRNA，bcl-2 mRNA的表達(dá)
　　（4）ELISA檢測AR、LN蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.本實(shí)驗(yàn)HCEC最適處理?xiàng)l件：高糖濃度為50mmo1/1，作用時(shí)間為48h；添加PDC的最適劑量為200μg/ml，作用時(shí)間為72h。
　　2.與C組相比，HG組HCEC細(xì)胞增殖活性降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率增加

5、（P＜0.05），細(xì)胞遷移能力下降（P＜0.05），bax mRNA，AR表達(dá)均增加（均P＜0.05），bcl-2mRNA，LN表達(dá)下降（P＜0.05）。
　　3.與C組相比，PDC組（200μg/ml）HCEC細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞遷移能力升高（均P＜0.05），對改善細(xì)胞凋亡的作用與對照組無差異（P＞0.05），bcl-2mRNA、LN表達(dá)上升，bax mRNA、AR表達(dá)下降（均P＜0.05）。
　　4.與HG組相比，HG+

6、PDC（200μg/ml）組HCEC細(xì)胞增殖活性升高（P＜0.05），但不能恢復(fù)到正常水平（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），與對照組無明顯差異（P＞0.05），bax mRNA，AR表達(dá)明顯下降（均P＜0.05），bcl-2mRNA，LN明顯增加（均P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.高糖能抑制HCEC增殖活性，誘導(dǎo)HCEC凋亡，AR表達(dá)增加，LN表達(dá)及遷移能力下降。
　　2.鐵皮石斛多糖能在高糖環(huán)境