轉SCaM-GFP融合基因煙草中鈣調素亞型的亞細胞定位研究.pdf

1、轉 S C a M - G F P 融 合 基 因 煙 草 中 鈣 調 素 業(yè) 型 的 亞 細 胞 定 些 塑 墮摘 要( R 室 一 系 列 工 作 證 明 了 植 物 細 胞 質 外 體 存 “ 鈣 調 素 ， ” “ 發(fā) 現 質 夕 卜 體 “ 調 素 與 胞內 鈣調 素 對C a “ 的 依 賴 性 及 對 靶 酶的 激 活 特 性等 基 本 相同， 但 在 某 些 方面 也有差異。 近年來發(fā)現植物細胞中 存在多種鈣調素亞型基因

2、， 他們在植物體中的表達 、 功 能 等 也 不 太 相 同 如了 研 究 質 外 體 鈣 調 素 與 胞 內 鈣 調 素 是 否 有 亞 型 的 區(qū) 別 ，從而確定質外 體鈣 調素基因， 本文利 用綠色熒光蛋白 ( G F P ) 作為 報告基因， 將其與大豆不同 鈣調素亞型基因 融合轉化煙草，觀察其在細胞中的表達定位，以 此確定質外體鈣調素基因亞型，及其與胞內鈣調素亞型的異同。( 首 先 分 別 構 建 了 含 融 合 基 因S C

3、 a M I - G F P . S C a M 1 - G F P . S C a M 3 - G F P .S C a M 4 - G F P , S C a M 5 - G F P的中間 載體 ( p U S G I , p U S G 2 , p U S G 3 , p U S G 4 ,p U S G 5 ) 和 雙 元 載 體 ( p G S G I , p G S G 2 , p G S G 3 , p G S G

4、 4 , p G S G 5 ) ， 同 時 構建了用作對照的雙元載體 p G T V - G F P , 將雙元載體用電擊法轉入農桿菌L B A 4 4 0 4 ， 獲 得含 有雙 元載體的L B A 4 4 0 4 菌 株。其次 在 原 核表 達系統(tǒng)中 鑒定G F P 的 熒 光表達 特性， 接著用基因 槍法將5 個包含 融合 基因 的 中 間 載 體 轉 化 番 茄愈 傷 組 織 進 行了 瞬時 表 達 鑒 定， 以 質粒p U

5、C - G F P作為 對照， 結 果表明 構 建的 質粒能 夠在植物 細胞中 表達發(fā)出 綠色熒 光， 可以 用于以 下的穩(wěn)定性轉化實驗最后選擇雙元載體p G S G I ( 含S C a M l ) 和p G S G 4 ( 含S C a M 4 ) ， 利 用葉 盤法分 別 轉 化 煙 草 ， 以p G T V - G F P 作 為 對 照 ， 在 抗 性 培 養(yǎng) 基 上 進 行 篩 選 獲 得 陽 性 愈傷組織。 為了 對轉基因

6、愈傷組織進一步鑒定， 提取愈 傷組織基因組以G F P 基因兩端序列為引 物， 用P C R 擴增出了G F P 基因， 從 而證明了 實 驗中 所觀察的愈 傷組織為 陽 性 愈 傷 組 織。 以C B W ( 1 3 % 的 甘 器 醉， 1 0 n i M的T r i s , P H 值 為7 . 0 ) 質 壁 分 離液進行單 細胞 質壁分離， 在激光共聚焦掃描顯 微鏡下觀察， 發(fā) 現轉 S C a M I - G F P融合基

7、因的 煙草愈 傷組織細胞壁上有明顯綠色熒光分布; 而轉G F P基因的對照組一 — 蘭S C a M - G F P 絲 ) l l } l 塑塑塑翌竺B 型AB S T R ACTO u r p r e v i o u s s t u d i e s s h o w e d e x i s t e n c e o f a p o p l a s t C a M i n t h e p l a n t s ,a

8、n d t h e r e w a s a l i t t l e d i f e r e n c e i n b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s b e t w e e n i n t r a -a n d e x t r a - C a M . M u t i p l e g e n e s o f C a M i s o f o r m s w e

9、r e f o u n d i n t h e p l a n tc e l l s , w h i c h h a v e s o m e d i f e r e n c e i n e x p r e s s i o n a n d i n f u n c t i o n . I n o r d e r t oc o n f i r m a p o p l a s t C a M i s o f

10、 o r m i s d i f e r e n t f r o m i n t r a c e l l u l a r C a M i s o f o r ma n d i d e n t i f y t h e g e n e o f a p o p l a s t C a M, w e c o n d u c t e d t h e f o l l o w i n ge x p e r i m e

11、n t s .F i r s t , t h e d i f e r e n t g e n e s o f s o y b e a n C a M i s o f o r m s ( S C a M 1 、S C a M 2 ,S C a M 3 、 S C a M 4 、 S C a M 5 ) w e r e r e s p e c t i v e l y c l o n e d i n t o p U

12、C - G F Pp l a s m i d t o f o r m i n t e r m e d i a t e v e c t o r s p U S G I , p U S G 2 , p U S G 3 , p U S G 4 ,p U S G 5 , a n d t h e s e c h i m e r i c g e n e s ( S C a MI - G F P、 S C a M 2 - G

13、 F P、S C a M 3 - G F P , S C a M 4 - G F P , S C a M 5 - G F P ) a n d G F P g e n e w e r e t h e ne x c i s e d w i t h H i n d I I I ( E c o R I a n d l i g a t e d i n t o t h e b i n a r y v e c t o r

14、p G T V t o f o r mp l a s m i d s p G S G I , p G S G 2 , p G S G 3 , p G S G 4 , p G S G 5 , p G T V G F Pr e s p e c t i v e l y . T h e s e b i n a r y v e c t o r s w e r e t r a n s f e r r e d i n t o

15、 A g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s s t r a i n L B A 4 4 0 4 b y e l e c t r o p o r a t i o n .S e c o n d l y , t r a n s i e n t e x p r e s s i o n o f G F P w a s d e t e c t e d i n t h e

16、c a l l u s o ft o m a t o a f t e r b o m b a r d m e n t w i t h t h e c o n s t r u c t s , t h e r e s u l t s s h o w e dd e mo n s t r a t e d t h e c o n s t r u c t s c o u l d b e u s e d i n s t

17、 a b l e t r a n s f o r ma t i o nF i n a l l y , t h e b i n a r y v e c t o r s p G S G I a n d p G S G 4 w h i c h r e s p e c t i v e l yc o n t a i n S C a M1 a n d S C a M4 w e r e c h o s e n t o

18、t r a n s f o r m t h e t o b a c c o ,p G T V G F P w a s u s e d a s c o n t r o l . T r a n s g e n i c c a l l u s o f t o b a c c o w e r ep r o d u c e d v i a A g r a b a c t e r l u m - m e d i a t e