玉米ZmMYB59轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子功能鑒定及在煙草中的表達(dá)分析.pdf

1、種子能否順利出土萌發(fā)直接關(guān)系到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是否獲得豐收，研究種子萌發(fā)性狀對(duì)促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。為探討玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子基因Zm MYB59在種子萌發(fā)中的功能，前期構(gòu)建pCAMBIA3301-ZmMYB59-Bar植物過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，并分析了ZmMYB59基因在不同播深及萌發(fā)過(guò)程中的表達(dá)情況。本文通過(guò)構(gòu)建植物表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化和鑒定獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻植株，對(duì)ZmMYB9基因的啟動(dòng)子功能進(jìn)行了鑒定;對(duì)ZmMYB59基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行了定

2、位;對(duì)ZmMYB59轉(zhuǎn)基因煙草T2代種子在逆境脅迫下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)、SOD、POD、CAT、APX酶活性及MDA、Pro、葉綠素含量進(jìn)行了分析。研究結(jié)果表明:
　　1.ZmMYB59基因所表達(dá)的蛋白的亞細(xì)胞定位研究
　　從玉米自交系B73中克隆得到ZmMYB59基因，構(gòu)建了35S ZmMYB59-EYFP的融合表達(dá)載體，進(jìn)行該基因的亞細(xì)胞定位分析。日本晴水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的研究結(jié)果表明:ZmMYB59蛋白定

3、位于細(xì)胞核。
　　2.ZmMYB59基因的啟動(dòng)子缺失研究
　　克隆ZmMYB59基因起始密碼子前1000bp和2000bp，2個(gè)啟動(dòng)子片段分別命名為MYB59-P、MYB9-P-2，構(gòu)建GUS植物表達(dá)載體pCXGUS-MYB-1K，pCXGUS-MYB-2K，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化日本晴水稻獲得GUS植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因植株?？山?jīng)過(guò)GUS染色法觀察外源基因的時(shí)空表達(dá)模式，預(yù)測(cè)ZmMYB59基因啟動(dòng)子中重要的motif。分別對(duì)轉(zhuǎn)

4、pCXGUS-MYB-1K,pCXGUS-MYB-2K的T1代種子、萌發(fā)期和苗期的根、莖、葉進(jìn)行GUS染色，GUS染色結(jié)果表明:pCXGUS-MYB-1K的種子沒(méi)有著色，pCXGUS-MYB-2K的種子胚乳邊緣著色;種子萌發(fā)期pCXGUS-MYB-1K只有芽尖著色，pCXGUS-MYB-2K芽尖和根均著色，芽尖著色較深，根維管束細(xì)胞少量著色;苗期pCXGUS-MYB-1K，pCXGUS-MYB-2K植株的根、莖、葉均能著色。推測(cè)ZmMY

5、B59基因的啟動(dòng)子可能是組成型啟動(dòng)子，同時(shí)也說(shuō)明MYB59-P是啟動(dòng)子發(fā)揮正常調(diào)控功能所必須的;而后者的根、莖、葉染色均比前者深，說(shuō)明MYB59-P啟動(dòng)能力不強(qiáng)，推測(cè)MYB59-P-2中可能存在增強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)的順式作用元件。
　　3.ZmMYB59基因在T2代轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析
　　對(duì)ZmMYB59基因過(guò)表達(dá)T2代煙草種子1cm播深（沙子）下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及根長(zhǎng)、苗高、葉寬;1.5％NaCl、8％P

6、EG和1cm播深下的SOD、POD、CAT、APX酶活性和MDA、Pro、葉綠素含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明:在1cm播深發(fā)芽實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、鮮重都顯著降低，其中發(fā)芽率、活力指數(shù)、鮮重達(dá)到極顯著差異;1cm播深30d后轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比根長(zhǎng)、苗高、葉寬顯著降低，苗高和葉寬達(dá)到極顯著差異。1.5％NaCl處理48h后的過(guò)表達(dá)煙草與野生型煙草相比，SOD、POD、CAT和APX酶活性顯著

7、降低，Pro含量極顯著降低，MDA含量顯著升高;8％PEG處理48h后的過(guò)表達(dá)煙草與野生型相比，CAT、POD酶活性極顯著降低，SOD酶活性顯著降低，APX酶活性、Pro含量降低但不顯著，葉綠素含量極顯著升高;1cm播深處理48h后過(guò)表達(dá)煙草與野生型相比，CAT、POD、APX酶活性顯著降低，SOD酶活性極顯著降低，Pro含量極顯著降低，MDA含量升高但不顯著。脅迫處理后，過(guò)量表達(dá)ZmMYB59基因顯著降低了煙草ROS清除酶活性，而MD