Apoptin亞細(xì)胞定位機(jī)理研究.pdf

1、為研究Apoptin在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中亞細(xì)胞定位的機(jī)理,首先考察了帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)簽的Apoptin在各種不同腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位.為研究Apoptin在腫瘤細(xì)胞中核定位的機(jī)制,通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了Apoptin的核定位信號(hào).在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了一系列核定位信號(hào)突變體,以EGFP作標(biāo)簽,通過熒光觀察分析Apoptin及其突變體的亞細(xì)胞定位.通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Apoptin還含有一個(gè)可能的核外運(yùn)信號(hào).為了確定A

2、poptin的pNES是否具有核外運(yùn)功能,采用核外運(yùn)特異性抑制劑leptomycin B(LMB)處理大鼠原代肝細(xì)胞.另外,實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)Apoptin的pNES決定了Apoptin在細(xì)胞中形成聚合體的能力.Apoptin的pNES缺失體在細(xì)胞中幾乎不能形成明顯的積聚體.而在大腸桿菌中表達(dá)的Apoptin的pNES缺失體其形成包涵體的能力也明顯降低,幾乎全部以可溶性的形式存在.與此對(duì)照的是,在大腸桿菌中表達(dá)的野生型Apoptin則主要以包

3、涵體的形式存在,并且其變性和復(fù)性均較困難.鑒于包涵體的形成常常與蛋白質(zhì)的積聚傾向有密切的關(guān)系.上述結(jié)果說明Apoptin的pNES對(duì)于Apoptin積聚體的形成是有重要貢獻(xiàn)的.重組表達(dá)的pNES缺失體,不能形成雙體分子,而野生型Apoptin可以形成雙體,這進(jìn)一步說明pNES對(duì)Apoptin聚合體的形成是必需的.此外,采用金屬離子螯合柱輔助復(fù)性技術(shù)解決了重組Apoptin復(fù)性難的問題.研究還發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中表達(dá)的Apoptin經(jīng)體外復(fù)性

4、后以單體或二聚體的形式存在,并不形成多聚體,這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果不同.文獻(xiàn)報(bào)道體外復(fù)性的Apoptin形成30~40亞單位組成的多聚體.總之,該研究發(fā)現(xiàn)了Apoptin的雙組分核定位信號(hào),證明了該雙組分核定位信號(hào)不具有腫瘤細(xì)胞特異性,不受磷酸化作用調(diào)控.Apoptin的腫瘤細(xì)胞特異性核定位依賴于其pNES和NLS的同時(shí)存在.Apoptin的N端1-46氨基酸包含細(xì)胞質(zhì)滯留信號(hào).Apoptin在正常細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)定位是由于其胞質(zhì)滯留作用和核