馬鈴薯（Solanum berthaultii）中花粉特異表達(dá)基因SB401功能研究.pdf

1、SB401基因是一個編碼高賴氨酸蛋白的馬鈴薯(Solanum berthaultii)花粉特異表達(dá)基因,我們構(gòu)建了在CaMV 35S啟動子驅(qū)動下的SB401基因的正義表達(dá)、反義RNA和RNAi載體,導(dǎo)入馬鈴薯,利用超量表達(dá)、異位表達(dá)、反義阻斷以及RNA干擾效應(yīng)改變植物內(nèi)源SB401基因的表達(dá);通過對轉(zhuǎn)基因植株花和花藥表型的分析,探討SB401基因在馬鈴薯花粉發(fā)育過程中的確切功能作用.該實(shí)驗(yàn)中,我們構(gòu)建了正義、反義表達(dá)載體和RNA干擾載體

2、,優(yōu)化了馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系;通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化,我們將這三種載體導(dǎo)入馬鈴薯中,分別獲得了超表達(dá)、反義抑制、RNA干擾和轉(zhuǎn)基因植株,得到了反義和RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株的花和花藥;PCR和Southern檢測證明外源T-DNA已插入植物基因組中;葉片組織的Northern雜交顯示SB401基因可以在正義表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株葉片組織中轉(zhuǎn)錄,在部分反義表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中有反義轉(zhuǎn)錄本的存在,而在RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株中未檢測到;分別取對照、反義表達(dá)和RNA干擾轉(zhuǎn)

3、基因馬鈴薯成熟花藥中的花粉,分析其內(nèi)源SB401 mRNA和蛋白質(zhì)的抑制情況,半定量RT-PCR和western blot檢測表明在部分的轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源SB401 mRNA的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)被阻抑了,western blot的結(jié)果顯示在被抑制的轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源蛋白的抑制程度不同.而這種抑制呈一個梯度效應(yīng),即有的植株中目的蛋白抑制程度較高、有的中等、有的較弱.兩個正義表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株5和17均有外源蛋白在葉片組織中表達(dá).在掃描電鏡視野中

4、,對照非轉(zhuǎn)基因植株成熟花粉粒形態(tài)飽滿,大小均一;而反義表達(dá)和RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)異常的花粉粒皺縮扁癟,嚴(yán)重凹陷,基本不含內(nèi)容物;這兩種轉(zhuǎn)基因植株在小孢子發(fā)育前、中期,花粉壁完整,有細(xì)胞核,中間有大量液泡;而在隨后的時期中,發(fā)現(xiàn)小孢子停止了發(fā)育,細(xì)胞質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重地收縮,緊靠在花粉壁邊,最后只留下抗分解的花粉壁殘骸,局部放大的照片顯示,此時細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重地收縮,緊靠在花粉壁邊,最后只留下抗分解的花粉壁殘骸,局部放大的照片顯示,此時細(xì)胞質(zhì)中細(xì)

5、胞器結(jié)構(gòu)已模糊不清,細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)被破壞.由于SB401基因是一個花粉特異表達(dá)的晚期基因,在有絲分裂之后才大量表達(dá);由此我們認(rèn)為在反義和RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株的花粉發(fā)育中,缺失該基因的功能將使小孢子形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯異常,最終不能發(fā)育成正常雙核成熟花粉.轉(zhuǎn)基因反義和RNA干擾植株花的形態(tài)發(fā)生變化,有的雄蕊數(shù)目發(fā)生了變化,增加到6-8個,而且雄蕊外形上不飽滿、發(fā)生了彎曲,長度變短,有的發(fā)生雄蕊花瓣化和重瓣的現(xiàn)象;正義轉(zhuǎn)基因株系在進(jìn)入生殖生