基于基因免疫的綠色熒光蛋白單克隆抗體制備與鑒定.pdf

1、近十年來綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及醫(yī)藥學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用.針對原核表達(dá)GFP作為免疫原制備單抗有一定困難的實(shí)際情況,該研究采用基因免疫的方法制備單抗.實(shí)驗(yàn)中以表達(dá)GFP的真核質(zhì)粒pVAX1-EGFP為免疫原,建立了有效的免疫程序,并成功研制出GFP的特異性單克隆抗體.真核質(zhì)粒pVAX<,1>-EGFP免疫程序大致步驟為:大提純化質(zhì)粒pVAX1-EGFP,經(jīng)

2、瓊脂糖電泳和真核細(xì)胞(P815)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)鑒定后,經(jīng)腿部雙側(cè)股四頭肌注射免疫6周齡雌性BALB/c小鼠,每只小鼠質(zhì)粒免疫劑量為100μg,三周后同法進(jìn)行第二次免疫,六周后第三次免疫,第九周加強(qiáng)免疫,加強(qiáng)免疫后一周采血測血清ELISA抗體效價(jià),同時取免疫小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0-Ag-14進(jìn)行融合.以間接ELISA試驗(yàn)進(jìn)行篩選,篩選出陽性克隆,并經(jīng)有限稀釋法三次亞克隆之后,共獲得四株穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為

3、1A12,3C8,3D6,4D9.對單抗的特異性鑒定結(jié)果表明,雜交瘤培養(yǎng)上清的間接ELISA效價(jià)分別為1:3200、1:1600、1:3200、1:2560,腹水效價(jià)為1:50000、1:13000、1:40000、1:25000.四株單抗的免疫球蛋白亞類均為IgG<,1>.在Dot-ELISA試驗(yàn)中四株單抗均與原核表達(dá)GFP的菌株反應(yīng),而對其它菌株不反應(yīng).經(jīng)過Western-blot分析,四株單抗均與27KD條帶處的GFP反應(yīng),而不與