25301.大腸桿菌中類脂a分子結(jié)構(gòu)的定向改造

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明1938361本人聲明所呈交的學(xué)位論文是拳人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含本人為獲得江南大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。簽名：4叢礙二一日期：立虹且扯關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本學(xué)位論文作者完全了解江南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文

2、的規(guī)定：江南大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。簽名：[睦叢碰導(dǎo)師簽名：日期：摘要類脂A是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞外膜外側(cè)脂多糖的主要組成成分，也是內(nèi)毒素的活性成分，可以被宿主免疫細(xì)胞識別并引發(fā)體內(nèi)的病原反應(yīng)。類

3、脂A的合成途徑相對保守，但在轉(zhuǎn)運(yùn)到外膜外側(cè)的過程中它的結(jié)構(gòu)會發(fā)生不同的修飾作用以適應(yīng)不同的外界環(huán)境。類脂A的結(jié)構(gòu)修飾在細(xì)菌體內(nèi)受到的調(diào)控非常嚴(yán)謹(jǐn)且與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)，卻不影響細(xì)菌的生長繁殖。本課題立足于該領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，以野生型大腸桿菌的類脂A分子為研究對象，以疫苗佐劑MPL為類脂A定向改造的最終目標(biāo)，對大腸桿菌中類脂A分子結(jié)構(gòu)的修飾進(jìn)行了一定的研究，取得的主要成果如下：(1)分別構(gòu)建了重組載體pWSK29pagL和pWSK29

4、pagP，對PagL和PagP在大腸桿菌W3110中的表達(dá)及其對類脂A的修飾進(jìn)行了初步的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然二者均為與類脂A脂肪酸鏈修飾相關(guān)的細(xì)胞外膜蛋白，但是在W3110中表達(dá)后它們對類脂A結(jié)構(gòu)的修飾作用相差卻很大：PagL表達(dá)后能催化絕大部分類脂A的脫酰基化，而PagP表達(dá)后對類脂A結(jié)構(gòu)的修飾作用卻非常有限，說明與PagL的修飾作用相比，大腸桿菌的pagP基因不但受到PhoPPhoQ轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，其表達(dá)產(chǎn)物PagP的活性也受到其他外

5、界條件的影響。(2)構(gòu)建了三個目的基因共表達(dá)的重組載體pWSK29pagL1pxEpagP，實(shí)現(xiàn)了MPL的大腸桿菌體內(nèi)合成，但是菌株中類脂A的成分比較復(fù)雜，含有四種經(jīng)過修飾的類脂A結(jié)構(gòu)，其中MPL的比例較小。(3)建立了一種簡單快速高效的用于外源基因在大腸桿菌染色體腸以位點(diǎn)上整合表達(dá)的新方法，選用cat作為報告基因驗證了該方法的可行性，結(jié)果表明大腸桿菌突變株W3110cat具有氯霉素的抗性但對卡那霉素敏感，說明cat基因在染色體上可以正

6、常表達(dá)并去除了用于篩選的抗性標(biāo)記。該方法的建立為類脂A結(jié)構(gòu)的定向改造提供了一種不依賴于載體的新途徑。(4)利用上述染色體整合表達(dá)的方法構(gòu)建了三種大腸桿菌突變株CW001、CW002和CW004：CW001的染色體上整合有來自弗朗西斯菌的lpxE基因，IPTG誘導(dǎo)的條件下幾乎所有的類脂A都被單磷酸類脂A代替，為單磷酸類脂A衍生物的開發(fā)提供了良好的出發(fā)菌株；CW002的染色體上整合有來自沙門氏菌的pagL基因和來自弗朗西斯菌的IpxE基因，