關(guān)中奶山羊BAC文庫構(gòu)建及其利用Red系統(tǒng)同源重組的研究.pdf

1、一種新型的載體系統(tǒng)——細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)已經(jīng)發(fā)展成為構(gòu)建復(fù)雜基因組文庫的重要方法.BAC文庫在基因組研究中起著關(guān)鍵作用,對(duì)BAC的修飾在分析和研究基因體內(nèi)和體外的功能和表達(dá)方面也有很重要的作用.利用Red系統(tǒng)進(jìn)行的基因同源重組技術(shù)擴(kuò)展了BAC文庫的應(yīng)用范圍,并為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究克服轉(zhuǎn)基因表達(dá)的"位置效應(yīng)"提供了新的思路.該研究的目的就是構(gòu)建具有高產(chǎn)奶性能的關(guān)中奶山羊基因

2、組DNA的BAC文庫,及利用Red重組系統(tǒng)將天然的人組織型纖溶酶原激活劑(ht-PA)的編碼序列置換掉BAC克隆中的β-酪蛋白的編碼序列,用β-酪蛋白的調(diào)控序列指導(dǎo)ht-PA的表達(dá),以消除轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源基因的"位置效應(yīng)",為制備表達(dá)ht-PA的動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器提供一個(gè)有效的載體.該論文由2部分組成:1.用脈沖電泳技術(shù)分離大片段DNA,以電透析法回收DNA后,與用BamHI酶切和CIAP(牛小腸堿性磷酸酶)脫磷的pBeloBAC11載體

3、連接,然后電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH10B,得到了關(guān)中奶山羊基因組的部分BAC文庫,插入片段平均大小為30~40kb.摸索了BAC載體制備、高分子量DNA制備、酶切、連接和電擊轉(zhuǎn)化等一系列環(huán)節(jié)對(duì)高效轉(zhuǎn)化產(chǎn)生大片段DNA的BAC的影響,為整個(gè)文庫的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ).2.構(gòu)建了兩個(gè)攜帶Zeocin抗性的ht-PA的載體,一個(gè)含有牛生長激素polyA信號(hào)(Bovine growth hormone polyadenylation signal,BG