小麥籽粒多酚氧化酶（PPO）活性功能標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用研究.pdf

1、多酚氧化酶(PPO)是導(dǎo)致面條、饅頭、餃子等面制食品發(fā)生褐變的主要因素,降低小麥籽粒中的PPO活性可以有效改善面制食品的外觀品質(zhì)。由于目前主要采用生化的方法測定小麥籽粒中的PPO活性,存在成本高、易受環(huán)境影響、不能在育種早代材料中檢測、選擇效率低等問題,因此研究小麥PPO基因遺傳變異的規(guī)律,開發(fā)出小麥籽粒PPO活性功能標(biāo)記,對于低籽粒PPO活性分子育種和我國面制食品外觀品質(zhì)的改良有重要意義。本研究對NCBI上最新公布的小麥PPO基因序列

2、進(jìn)行了搜索和比對并根據(jù)在小麥籽粒中表達(dá)的PPO基因序列設(shè)計引物,對這些引物的功能進(jìn)行驗證,開發(fā)小麥籽粒PPO活性功能標(biāo)記。同時研究中國小麥種質(zhì)資源的籽粒PPO活性遺傳變異和基因型的分布規(guī)律以及PPO基因的等位變異對籽粒PPO活性的影響,獲得了如下主要結(jié)果： 1.根據(jù)NCBI網(wǎng)站上新注冊的3條小麥PPO基因(GenBank:AY515506、AY596270和AF507945)序列,在不同位置設(shè)計了多對引物,對7個高PPO活性和7

3、個低PPO活性小麥品種進(jìn)行PCR擴增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一對引物(STS01)在高、低PPO活性材料中表現(xiàn)出多態(tài)性。該引物在7個低PPO活性的材料中能擴增出560 bp的目標(biāo)片段,在7個高PPO活性的材料中沒有擴增出目標(biāo)片段,利用中國春缺體、四體及雙端體將該標(biāo)記定位在2D染色體長臂上。利用該標(biāo)記檢測130份小麥品種,結(jié)果表明有75個品種可以擴增出560 bp的目標(biāo)片段,其PPO活性均值為221.08;55個品種沒有擴增出目標(biāo)片段,PPO活性均

4、值為309.98,方差分析表明兩者的差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。利用STS01和PPO18(小麥2A染色體上PPO基因STS分子標(biāo)記)共同檢測后發(fā)現(xiàn),在130份小麥品種中有37個品種的雙標(biāo)記擴增均表現(xiàn)出高活性帶型(H1H2),這些品種PPO活性的均值為337.82,顯著高于其他幾種擴增帶型品種的PPO活性均值(P<0.01)。32個雙標(biāo)記擴增均表現(xiàn)為低活性帶型(L1L2)的小麥品種PPO活性值普遍較低,可作為改良面制食品外觀品質(zhì)的

5、候選親本。因此STS01是一個位于小麥2D染色體長臂上PPO基因分子標(biāo)記,可以在小麥PPO活性分子標(biāo)記輔助選擇中加以應(yīng)用。 2.通過對NCBI上注冊的小麥PPO基因序列的搜索與比對后發(fā)現(xiàn),現(xiàn)有的小麥PPO基因按表達(dá)方式可分為兩大類(Ⅰ、Ⅱ),其中第Ⅱ大類的PPO基因與小麥籽粒PPO活性密切相關(guān),第Ⅱ大類第i小類中的PPO基因可能位于小麥2A、2D以外的染色體上,可做為改良面團(tuán)色澤的侯選基因。通過對具有完整開放閱讀框(ORF)的4

6、條PPO基因比對后發(fā)現(xiàn),位于小麥2D染色體長臂上的PPO基因(PPO-2D)存在豐富的等位變異,等位基因間有94個單核苷酸變異(SNP),其中發(fā)生在編碼區(qū)的有80個(cSNP),這些cSNP中有36個影響到基因編碼的氨基酸序列,屬非同義cSNP。在非同義cSNP處,設(shè)計引物(STS-H),對130個已連續(xù)測得兩年P(guān)PO活性的小麥品種進(jìn)行PCR擴增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)STS-H在大部分低PPO活性品種中沒有擴增出目標(biāo)片段(a),而大部分高PPO活性

7、品種可以擴增出460bp的目標(biāo)片段(b)。方差分析表明,a、b兩種類型品種的PPO活性均值差異達(dá)極顯著水平(p<0.01),說明非同義cSNP對小麥籽粒PPO活性有重要影響。與STS01比較后發(fā)現(xiàn),STS-H與STS01是一對互補標(biāo)記,根據(jù)STS01和STS-H引物各自的特點,研究了能同時擴增兩對引物的多重PCR反應(yīng)體系。 3.以251份基因多樣性豐富的中國小麥微核心種質(zhì)資源為試驗材料,2004-2005年度種植于兩個地點(安徽

8、合肥、鳳陽),采用生化和特異引物PCR擴增的方法對其PPO活性及基因型進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明：中國小麥微核心種質(zhì)資源品種間PPO活性差異明顯,并且低PPO活性的品種居多；基因型、地點及其互作對PPO活性的影響達(dá)到1％顯著水平。利用控制小麥PPO活性兩個主效基因位點的特異PCR引物擴增結(jié)果表明,中國小麥微核心種植資源中共檢測出PPO-2Aa1/PPO-2Da2(a1a2)、PPO-2Aa1/PPO-2Db2(a1b2)、PPO-2Ab1/P

9、PO-2Da2(b1a2)和PPO-2Ab1/PPO-2Db2(b1b2)四種標(biāo)記基因型,標(biāo)記基因型間PPO活性均值的大小順序為:a1a2

10、Db2的4倍,單倍型效應(yīng)分析表明相同染色體上單倍型間的PPO活性關(guān)系為:PPO-2Aa1

11、著(P<0.01)低于來源于3個春麥區(qū)小麥品種的PPO活性均值；地方小麥品種的PPO活性均值最低,顯著(P<0.01)低于育成品種和國外引進(jìn)品種的PPO活性均值,說明小麥PPO活性在地區(qū)分布上存在一定的規(guī)律性,小麥品種的PPO活性與品種來源和人工選擇有關(guān)。 4.為了克隆出小麥不同染色體上控制籽粒PPO活性的PPO基因,利用小麥2A和2D染色體上PPO基因一致性高的特點,在兩個基因(PPO-2A和PPO-2D)相同序列處設(shè)計了一對

12、引物(PPO05),對高、低活性不同的小麥品種進(jìn)行擴增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.5％瓊脂糖凝膠上PPO05在低PPO活性小麥品種中可以擴增出兩條帶(a：位于DNA Marker1000-750bp之間和b：750-500bp之間),而在高PPO活性小麥品種中只擴增出一條位于750-500bp之間的條帶(b)。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果發(fā)現(xiàn)b條帶實際包含2-3條長度相近的DNA片段。對這些條帶進(jìn)行分離、純化和測序,并在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST