13321.dna磷硫修飾蛋白dnde的表達結構與功能研究

1、ExpressionstructureandfunctionofDndEinvovledinByChengkunWangADissertationSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofScienceShanghaiInstituteofOrganicChemis

2、tryChineseAcademyofScience06／2013摘要摘要DNA磷硫修飾是最新被發(fā)現(xiàn)的第一類發(fā)生在DNA骨架上的生理修飾，其是由dnd基因編碼的DndA、DndB、DndC、DndD、DndE蛋白所調(diào)控。生物信息學分析DndE蛋白可能是一類NCAIR合成酶的同源蛋白或者一種PAPS硫轉(zhuǎn)移酶的同源蛋白，這種功能推測上的模糊性為進一步開展DNA磷硫修飾的研究帶來了巨大的挑戰(zhàn)。因此為了解決這一難點，并準確闡述DndE蛋白的生理

3、功能，本論文選擇DndE蛋白作為研究對象。為了研究DNA磷硫修飾在物種上的保守性和進化性，我們選擇了來源于EscherichiacoliBTASalmonPllaente，icasubspentericaserovarSaintpaulslrSARA23aStreptomyceslividans66三種物種的DndE蛋白作為進一步的研究對象。首先摸索了這三種DndE蛋白的表達純化條件，最終發(fā)現(xiàn)當利用pSMT3載體進行異源表達與純化的時候

4、，才能獲得比較穩(wěn)定的DndEB7NIl0、DndEsadmfull、DndENflag1i。daJl蛋白。我們對其開展了NMR研究，卻發(fā)現(xiàn)三種DndE蛋白均存在構象不均一，多聚現(xiàn)象等，且這種多聚與DndE蛋白的濃度有關系。為了改善譜圖質(zhì)量，我們采用多種方法對其進行了優(yōu)化，最后發(fā)現(xiàn)只有DndEs7。N110蛋白在Tris緩沖液，pH79的條件下構象才比較均一，但是令人遺憾的是在該條件下DndE蛋白仍然存在多聚現(xiàn)象，無法利用NMR方法對其進

5、行進一步的結構解析。鑒于此，我們尋求利用Xray方法對DndE蛋白進行結晶學研究。通過對三種DndE蛋白進行結晶篩選和晶體優(yōu)化，以及衍射數(shù)據(jù)的收集和處理，我們最終獲得了精修質(zhì)量完好的DndEB7。Nllo的晶體結構和初步的DndEs。lmfull結構。從晶體結構來看，DndE蛋白利用兩種不同形式的二聚體，進一步聚合成四聚體。此外研究還發(fā)現(xiàn)，在DndEB7aN110四聚體結構上存在兩種不同形式的凹槽以及一個正電荷空洞，分析這有可能是Dnd

6、E蛋白在體內(nèi)結合其底物所需要的活性位點。比較了DndE蛋白結構與NCAIR合成酶結構，以及PAPS硫轉(zhuǎn)移酶的結構，DndE蛋白與這兩種蛋白無結構同源性。體外等溫熱量滴定實驗(IsothermalTitrationCalorimetry，ITC)驗證了這一結論，據(jù)此推測DndE蛋白可能是一種新穎的未知功能蛋白。結構同源性搜索，發(fā)現(xiàn)DndE蛋白可能是一種骨架新穎的DNA結合蛋白。為了驗證這一點，我們設計了包含熒光素標記(FAM)標記的五種D