13321.dna磷硫修飾蛋白dnde的表達(dá)結(jié)構(gòu)與功能研究

1、ExpressionstructureandfunctionofDndEinvovledinByChengkunWangADissertationSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofScienceShanghaiInstituteofOrganicChemis

2、tryChineseAcademyofScience06／2013摘要摘要DNA磷硫修飾是最新被發(fā)現(xiàn)的第一類(lèi)發(fā)生在DNA骨架上的生理修飾，其是由dnd基因編碼的DndA、DndB、DndC、DndD、DndE蛋白所調(diào)控。生物信息學(xué)分析DndE蛋白可能是一類(lèi)NCAIR合成酶的同源蛋白或者一種PAPS硫轉(zhuǎn)移酶的同源蛋白，這種功能推測(cè)上的模糊性為進(jìn)一步開(kāi)展DNA磷硫修飾的研究帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。因此為了解決這一難點(diǎn)，并準(zhǔn)確闡述DndE蛋白的生理

3、功能，本論文選擇DndE蛋白作為研究對(duì)象。為了研究DNA磷硫修飾在物種上的保守性和進(jìn)化性，我們選擇了來(lái)源于EscherichiacoliBTASalmonPllaente，icasubspentericaserovarSaintpaulslrSARA23aStreptomyceslividans66三種物種的DndE蛋白作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。首先摸索了這三種DndE蛋白的表達(dá)純化條件，最終發(fā)現(xiàn)當(dāng)利用pSMT3載體進(jìn)行異源表達(dá)與純化的時(shí)候

4、，才能獲得比較穩(wěn)定的DndEB7NIl0、DndEsadmfull、DndENflag1i。daJl蛋白。我們對(duì)其開(kāi)展了NMR研究，卻發(fā)現(xiàn)三種DndE蛋白均存在構(gòu)象不均一，多聚現(xiàn)象等，且這種多聚與DndE蛋白的濃度有關(guān)系。為了改善譜圖質(zhì)量，我們采用多種方法對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化，最后發(fā)現(xiàn)只有DndEs7。N110蛋白在Tris緩沖液，pH79的條件下構(gòu)象才比較均一，但是令人遺憾的是在該條件下DndE蛋白仍然存在多聚現(xiàn)象，無(wú)法利用NMR方法對(duì)其進(jìn)

5、行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)解析。鑒于此，我們尋求利用Xray方法對(duì)DndE蛋白進(jìn)行結(jié)晶學(xué)研究。通過(guò)對(duì)三種DndE蛋白進(jìn)行結(jié)晶篩選和晶體優(yōu)化，以及衍射數(shù)據(jù)的收集和處理，我們最終獲得了精修質(zhì)量完好的DndEB7。Nllo的晶體結(jié)構(gòu)和初步的DndEs。lmfull結(jié)構(gòu)。從晶體結(jié)構(gòu)來(lái)看，DndE蛋白利用兩種不同形式的二聚體，進(jìn)一步聚合成四聚體。此外研究還發(fā)現(xiàn)，在DndEB7aN110四聚體結(jié)構(gòu)上存在兩種不同形式的凹槽以及一個(gè)正電荷空洞，分析這有可能是Dnd

6、E蛋白在體內(nèi)結(jié)合其底物所需要的活性位點(diǎn)。比較了DndE蛋白結(jié)構(gòu)與NCAIR合成酶結(jié)構(gòu)，以及PAPS硫轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)，DndE蛋白與這兩種蛋白無(wú)結(jié)構(gòu)同源性。體外等溫?zé)崃康味▽?shí)驗(yàn)(IsothermalTitrationCalorimetry，ITC)驗(yàn)證了這一結(jié)論，據(jù)此推測(cè)DndE蛋白可能是一種新穎的未知功能蛋白。結(jié)構(gòu)同源性搜索，發(fā)現(xiàn)DndE蛋白可能是一種骨架新穎的DNA結(jié)合蛋白。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了包含熒光素標(biāo)記(FAM)標(biāo)記的五種D