假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥基因缺失連接片段的克隆和應(yīng)用.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥基因缺失連接片段的克隆和應(yīng)用姓名：鐘敏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：陸兵勛潘速躍20060515摘要為了更多了解dystrophin基因缺失連接片段序列特點(diǎn)，我們的研究從克隆2例DMD／BMD病例的缺失連接片段出發(fā)，在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上在國(guó)內(nèi)首次采用PCR步移法對(duì)內(nèi)含子上的斷裂點(diǎn)進(jìn)行定位，然后直接以PCR法擴(kuò)增缺失連接片段。通過(guò)采用分次PCR步移法，初步探討在dystrophin基因大內(nèi)含

2、子上準(zhǔn)確定位斷裂點(diǎn)的策略；通過(guò)對(duì)2例缺失連接片段的克隆和測(cè)序，探討2例缺失連接片段斷裂點(diǎn)局部的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；隨后我們對(duì)這2例缺失連接片段和以往國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)公開(kāi)報(bào)道的55例有效缺失連接片段的序列資料進(jìn)行綜合分析，探討重復(fù)序列、基質(zhì)附著區(qū)(matrixattachmentregions，MARs)、TITAAA序列以及基因缺失后修復(fù)方式等因素在dystrophin基因缺失中的作用，以深入闡述dystrophin基因缺失的機(jī)制。同時(shí)基于目前DM

3、D，BMD的攜帶者檢測(cè)和產(chǎn)前診斷技術(shù)尚不成熟，國(guó)內(nèi)外均未常規(guī)開(kāi)展這方面的工作的現(xiàn)狀，我們?cè)谶M(jìn)一步完成1個(gè)BMD家系中6例患者／或攜帶者的基因缺失連接片段的克隆和測(cè)序分析后，對(duì)本項(xiàng)研究在攜帶者檢測(cè)和產(chǎn)前診斷上的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了初步探討。材料和方法1定位dystrophin基因缺失斷裂點(diǎn)的策略選擇2例臨床證實(shí)的男性DMD／BMD患者(例1為DMD散發(fā)病例，例2為一BMD家系先證者)，常規(guī)蛋白酶K和苯酚法抽提制備其外周血基因組DNA。通過(guò)188

4、對(duì)外顯予引物PCR反應(yīng)檢測(cè)證實(shí)例1患者為dystrophin基因第45～54外顯子缺失，例2患者為第3～5外顯子缺失。2例5’端斷裂點(diǎn)分別位于dystrophin基因龐大的第44和第2內(nèi)含子，在以上2個(gè)大內(nèi)含子上先各設(shè)計(jì)5對(duì)引物將內(nèi)含子序列人為地分成長(zhǎng)度大致均等的6個(gè)待查區(qū)域，經(jīng)第一次PCR反應(yīng)檢測(cè)確認(rèn)斷裂點(diǎn)所在區(qū)域后繼續(xù)在該區(qū)域每3kb序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物。2例3’端斷裂點(diǎn)分別位于第54和第5內(nèi)含子，引物設(shè)計(jì)為直接每3kb序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物