壇紫菜（Porphyra haitanensis）微衛(wèi)星序列的分離、特性及應(yīng)用.pdf

1、本文運(yùn)用尿素法和SDS法自壇紫菜絲狀體和葉狀體提取DNA，用CTAB/NaCl溶液去除剩余的多糖，反復(fù)多次，能純化得到高質(zhì)量的DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280值為1.84～1.93之間，瓊脂糖凝膠電泳可知大小為23kb左右，可用于壇紫菜DNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建、酶切反應(yīng)和SSR-PCR擴(kuò)增?！　∮孟拗菩詢?nèi)切酶Sau3AI處理提取的絲狀體DNA后，選擇性回收300～900bp的片段，然后將這些小片段DNA連接至經(jīng)BamH

2、I酶切并經(jīng)細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)去磷酸化處理后的pUC18質(zhì)粒載體上，最后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109感受態(tài)細(xì)胞中，從而構(gòu)建了壇紫菜部分小片段DNA質(zhì)粒文庫。經(jīng)藍(lán)/白斑篩選，獲得384個(gè)白色克??；選用pUC18質(zhì)粒的通用引物(5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'，5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')進(jìn)行PCR反應(yīng)來對(duì)這些陽性克隆進(jìn)一步篩選并檢測(cè)插入片段的大小，其中278個(gè)含有大小合適

3、的插入片段。將含有300～900bp之間插入片段的克隆送交測(cè)序，并利用網(wǎng)絡(luò)在線軟件進(jìn)行序列分析，在壇紫菜中獲得172個(gè)微衛(wèi)星序列，分別分布于103個(gè)不同的陽性克隆中。　　在發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星序列中選取了32條微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)了引物，然后進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增。SSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系為：0.4μM引物，200μMdNTPs，1.5mMMg2+，1UTaqDNA聚合酶，30ng左右模板DNA；優(yōu)化反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)體系，