重組四價(jià)Aβ-,1-15-基因工程肽的制備.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種多見(jiàn)于老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙和記憶損害。隨年齡增加，AD的發(fā)病率不斷上升。它的主要病理改變?yōu)榛颊吣X內(nèi)出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(β-amyloidpeptide，Aβ)沉積形成的老年斑，神經(jīng)纖維纏結(jié)及神經(jīng)元丟失。從報(bào)道首例AD病例到現(xiàn)在已近100年，AD的病因及其病理機(jī)制仍不十分明確，目前存在多種學(xué)說(shuō)和假設(shè)，其中以Aβ毒性學(xué)說(shuō)為大多數(shù)學(xué)者所接受。該

2、學(xué)說(shuō)認(rèn)為Aβ生成、聚合、沉積，繼而形成老年斑，同時(shí)伴隨神經(jīng)元損害，是AD病理機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。近年的研究對(duì)該學(xué)說(shuō)有了進(jìn)一步補(bǔ)充，認(rèn)為Aβ寡聚體的形成也是AD致病的主要原因。圍繞Aβ致病學(xué)說(shuō)展開(kāi)的以β-淀粉樣蛋白為靶的免疫治療是近年AD治療的熱點(diǎn)。 1999年Schenk等人首次報(bào)道用化學(xué)合成的Aβ<,42>肽疫苗皮下接種AD轉(zhuǎn)基因鼠，產(chǎn)生了特異性的抗Aβ<,42>抗體，阻止和減少了淀粉樣斑塊的形成。隨后多個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室先后發(fā)現(xiàn)采用主

3、動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫的方法均可以減少或清除AD轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的淀粉樣斑塊沉積并且改善了動(dòng)物的記憶功能和認(rèn)知能力。2001年，Elan公司率先進(jìn)行了抗老年性癡呆疫苗AN1792(主要成分為Aβ<,42>和佐劑QS-21)的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，取得了良好的效果。但在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，約6﹪的患者接種后出現(xiàn)了腦脊髓膜炎的癥狀，試驗(yàn)被迫中止。隨后的尸檢發(fā)現(xiàn)患者腦組織中存在T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。通過(guò)大量隨訪和實(shí)驗(yàn)，多數(shù)研究者們認(rèn)為Aβ<,42>肽C末端的T細(xì)胞

4、表位激發(fā)了Th1反應(yīng)，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)可能是Aβ<,42>肽疫苗免疫產(chǎn)生副作用的主要原因。選擇含有盡量少的引發(fā)細(xì)胞免疫的T細(xì)胞抗原決定簇，保留引發(fā)體液免疫的B細(xì)胞抗原決定簇的Aβ肽亞單位疫苗已成為大多數(shù)研究者的共識(shí)。隨后多家實(shí)驗(yàn)室采用化學(xué)合成或基因工程的方法制備出不同的Aβ亞單位片段加入不同類(lèi)型佐劑免疫動(dòng)物后，發(fā)現(xiàn)具有和Aβ<,42>肽疫苗同樣的免疫效果，同時(shí)避免了不良反應(yīng)。本課題組自2001年開(kāi)始AD系列疫苗的研究以來(lái)，先后合成和構(gòu)建

5、了MAP-Aβ<,1-15>肽疫苗，s4×Aβ<,1-15> DNA疫苗，GSN×Aβ<,1-15>和His6-4×Aβ<,1-15>融合蛋白疫苗等，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上均誘導(dǎo)出了較高的特異性抗體，減少了老年斑的沉積，改善了模型鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。 目的： 本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，擬去除前期構(gòu)建的PQE-4×Aβ<,1-15>載體目的基因前方不相關(guān)的基因片段，得到理論上更安全的疫苗。在設(shè)計(jì)上去除了Aβ的T細(xì)胞抗原決定簇，保留了B

6、細(xì)胞抗原決定簇避免了Aβ的毒性片段，同時(shí)采用柔性肽連接多個(gè)抗原片段，選擇較理想的純化標(biāo)簽和載體，用基因工程的方法制備新的四價(jià)Aβ亞單位蛋白疫苗，為開(kāi)發(fā)出更安全、廉價(jià)、效果理想的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的治療AD的疫苗奠定基礎(chǔ)。 材料和方法： 1.重組原核表達(dá)載體PQE30a-2×Aβ<,1-15>的構(gòu)建及鑒定 本室前期通過(guò)基因合成和PCR技術(shù)擴(kuò)增，得到六個(gè)甘氨酸連接的Aβ<,1-15>二價(jià)B細(xì)胞抗原表位基因片段，再用GS

7、GGSG linker串聯(lián)這兩個(gè)Aβ<,1-15>二價(jià)基因片段，命名為4×Aβ<,1-15>，克隆入PcDNA3.1載體，構(gòu)建成功了PcDNA3.1-s4×Aβ<,1-15>真核表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，以PcDNA3.1-S4×Aβ<,1-15>質(zhì)粒為模板，由于Aβ<,1-15>片段四次串聯(lián)重復(fù)，在引物設(shè)計(jì)時(shí)引物與模板的匹配不能完全一致，故考慮先擴(kuò)增兩個(gè)Aβ<,1-15>二價(jià)基因片段減少非特異性擴(kuò)增。設(shè)計(jì)上、下游引物時(shí)分別引入Bam

8、HI和SacI酶切位點(diǎn)，經(jīng)PCR擴(kuò)增出目的基因片段1-2×Aβ<,1-15>。將目的片段純化后酶切克隆入原核表達(dá)載體PQE30a中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后挑取陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并酶切鑒定，根據(jù)電泳情況初步確定陽(yáng)性克隆，命名為PQE30a-2×Aβ<,1-15>，將菌液送上海生物工程公司測(cè)序，進(jìn)一步鑒定。 2.重組質(zhì)粒PQE30a--4×Aβ<,1-15>的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)測(cè)序正確的PQE30a-2×Aβ<,1-15>質(zhì)

9、粒為模板擴(kuò)增另外兩個(gè)Aβ<,1-15>片段，較之以PcDNA3.1-s4×Aβ<,1-15>為模板特異性更高。引物設(shè)計(jì)時(shí)上、下游分別引入SacI和HindlIl酶切位點(diǎn)，經(jīng)PCR擴(kuò)增出目的基因片段2-2×Aβ<,1-15>。將目的片段純化酶切后克隆入PQE30a-2×Aβ<,1-15>重組質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后挑取陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并酶切鑒定，根據(jù)電泳情況初步確定陽(yáng)性克隆，命名為PQE30a-4×Aβ<,1-15>，將菌液送上

10、海生物工程公司測(cè)序，進(jìn)一步鑒定。 3.重組表達(dá)載體PQE30a-4xAβ<,1-15>在M15中的誘導(dǎo)表達(dá) 從E.Coli DH5α中提取重組質(zhì)粒PQE30a-4×Aβ<,1-15>純化后轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌E.Coli M15菌株中，摸索表達(dá)條件，包括IPTG濃度，誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度，使目的蛋白為可溶性表達(dá)，并得到較大表達(dá)。表達(dá)后裂解菌體，取上清進(jìn)行SDS-PAGE及Western blotting鑒定，鑒定其表達(dá)產(chǎn)物是否為我

11、們所需的可溶的目的蛋白。 4. 目的蛋白His6-4×~Aβ<,1-15>的大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化 采用優(yōu)化好的誘導(dǎo)條件進(jìn)行大量表達(dá)His6-4×Aβ<,1-15>融合蛋白，利用6×his標(biāo)簽通過(guò)Ni<,2+>-NTA親和層析純化目的蛋白，小量純化摸索純化條件，15﹪SDS-PAGE電泳分析純化效果，大量純化目的蛋白后用超濾濃縮管超濾、濃縮，并進(jìn)行定量。 結(jié)果： 1.構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體PQE30a-2×A

12、β<,1-15>以PcDNA3.1-s4×Aβ<,1-15>真核表達(dá)質(zhì)粒為模板，相應(yīng)的引物PCR擴(kuò)增出目的片段1-2×Aβ<,1-15>基因，其大小為110 bp，且同時(shí)正確引入了相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。克隆入PQE30a載體后，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)中，挑取陽(yáng)性克隆，酶切鑒定的結(jié)果表明目的基因已插入至PQE30a，中，測(cè)序結(jié)果表明重組載體中的2×Ap<,1-15>基因序列與已知序列相符合，未發(fā)現(xiàn)突變的堿基，且密碼子讀框正確。 2.構(gòu)建了

13、重組原核表達(dá)載體PQE30a-4×Aβ<,1-15>以測(cè)序正確的PQE30a-2×Aβ<,1-15>為模板，相應(yīng)的引物PCR擴(kuò)增出目的片段2-2×Aβ<,1-15>基因，其大小為110 bp，且同時(shí)正確引入了相應(yīng)的酶切位點(diǎn)?？寺∪隤QE30a--2×Aβ<,1-15>載體后，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)中，挑取陽(yáng)性克隆，酶切鑒定的結(jié)果表明目的基因已插入至PQE30a--2×Aβ<,1-15>中，在220 bp中可見(jiàn)4×Aβ<,1-15>的目的條

14、帶，測(cè)序結(jié)果表明重組載體中的4×Aβ<,1-15>基因序列與已知序列相符合，未發(fā)現(xiàn)突變的堿基，且密碼子讀框正確。 3.小量表達(dá)了目的蛋白His6-4xAβ<,1-15>PQE30a-4×Aβ<,1-15>轉(zhuǎn)化入EColi M15中，最佳誘導(dǎo)條件為IPTG 1 mM，30℃低溫誘導(dǎo)9 h可以獲得一定表達(dá)量的可溶性目的蛋白His6-4×Aβ<,1-15>，15﹪SDS-PAGE電泳在18 KD處可見(jiàn)誘導(dǎo)后有新生目的條帶，且主要在上清

15、中，Western blotting鑒定為我們所需的目的蛋白，可以和抗Aβ<,40>抗體特異性結(jié)合，具有免疫反應(yīng)性。 4.大量表達(dá)和純化了His6-4×Aβ<,1-15>融合蛋白以最佳誘導(dǎo)條件大量表達(dá)出目的蛋白，用Ni<'2+>-NTA親和層析純化目的蛋白，以40 mM咪唑濃度為洗滌濃度，300 mM咪唑濃度為洗脫濃度，15﹪SDS-PAGE電泳在18 KD處可見(jiàn)單一的目的條帶。純化后的目的蛋白經(jīng)超濾管超濾、濃縮，定量后保存于-

16、20℃。 結(jié)論： 1.利用基因工程的原理和技術(shù)成功構(gòu)建了優(yōu)化的原核表達(dá)載體PQE30a-4×Aβ<,1-15>，測(cè)序結(jié)果表明插入的目的基因序列無(wú)突變。 2.誘導(dǎo)表達(dá)了His<,6-4>×Aβ<,1-15>融合蛋白，且大部分為可溶性表達(dá)，并通過(guò)Ni<'2+>+-NTA樹(shù)脂純化，制備了四價(jià)B細(xì)胞抗原表位串聯(lián)的Aβ<,1-15>多肽。 3.Western blotting結(jié)果顯示制備的His<,6-4>×Aβ<