基因工程藥物——干擾素的制備

1、基因工程藥物—— 干擾素的制備,,中文名稱： 干擾素 英文名稱： interferon;IFN 定義1： 細(xì)胞因子中的一個(gè)家族，以干擾病毒復(fù)制而得名。根據(jù)產(chǎn)生細(xì)胞不同可分為α干擾素、β干擾素和γ干擾素三類。 應(yīng)用學(xué)科： 免疫學(xué)（一級(jí)學(xué)科）；免疫系統(tǒng)（二級(jí)學(xué)科）；免疫分子（三級(jí)學(xué)科） 定義2： 脊椎動(dòng)物受多種因素(如微生物)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組抗病毒蛋白質(zhì)?？捎绊懠?xì)胞的運(yùn)動(dòng)和免疫過(guò)程，也可干擾多種病

2、毒的復(fù)制而得此名。干擾素有Ⅰ型和Ⅱ型，以及干擾素樣細(xì)胞因子，Ⅰ型干擾素有7種：IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ和IFN-τ，人類沒(méi)有IFN-δ和IFN-τ；Ⅱ型僅有IFN-γ。 應(yīng)用學(xué)科： 生物化學(xué)與分子生物學(xué)（一級(jí)學(xué)科）；激素與維生素（二級(jí)學(xué)科） 定義3： 抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的一類活性蛋白質(zhì)。 應(yīng)用學(xué)科： 水產(chǎn)學(xué)（一級(jí)學(xué)科）；水產(chǎn)生物病害及防治（二級(jí)學(xué)科） 定義4： 因最

3、初發(fā)現(xiàn)某一種病毒感染的細(xì)胞能產(chǎn)生一種生物學(xué)活性物質(zhì)可干擾另一種病毒的感染和復(fù)制而得名。是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子。根據(jù)干擾素產(chǎn)生的來(lái)源和結(jié)構(gòu)不同可分為α干擾素、β干擾素和γ干擾素三類。 應(yīng)用學(xué)科： 細(xì)胞生物學(xué)（一級(jí)學(xué)科）；細(xì)胞免疫（二級(jí)學(xué)科）,干擾素概述,干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過(guò)細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復(fù)制；同時(shí)還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)

4、胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強(qiáng)抗病毒能力。干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們?cè)谕N細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長(zhǎng)，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。。,,干擾素發(fā)現(xiàn)發(fā)展歷程干擾素的生產(chǎn)企業(yè)干擾素的藥理作用、臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)干擾素的制備路線,50年前，英國(guó)的病毒學(xué)家艾力克·伊薩克斯(Alick Isaacs)在流感病毒研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在雞胚中

5、注射滅活流感病毒后，雞胚細(xì)胞中生成了一種物質(zhì)，這種物質(zhì)可以反過(guò)來(lái)“干擾(interfere)”流感病毒的生長(zhǎng)，于是就將這種物質(zhì)稱為干擾素(interferon)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)非常重要的細(xì)胞因子，不僅具有直接抗病毒作用，更重要的是它還具有免疫增強(qiáng)作用。干擾素獨(dú)具的雙重作用讓科學(xué)家們興奮不已。顯然它具備了成為攻克乙肝的利器的必要條件。但干擾素的人工合成、工業(yè)化生產(chǎn)乃至最后真正為攻克疾病作出貢獻(xiàn)，又經(jīng)歷了漫長(zhǎng)而艱辛的過(guò)程

6、。,一、干擾素的發(fā)現(xiàn)發(fā)展歷程,早期的干擾素是從人體白細(xì)胞中通過(guò)純化技術(shù)提取的，不僅量少，且含有很多雜質(zhì)，導(dǎo)致作用有限。直到70年代中期，隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展和基因重組技術(shù)的出現(xiàn)，科學(xué)家們逐漸開(kāi)始嘗試通過(guò)基因重組技術(shù)合成干擾素。1978年，瑞士羅氏公司的科學(xué)家帕斯特卡(Pestka)成功克隆了干擾素cDNA，為后來(lái)干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。1990年，基因重組技術(shù)正式應(yīng)用于干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)，于是今天所說(shuō)的“普通干擾素”開(kāi)始批量生產(chǎn)。但

7、是，普通干擾素也給患者和醫(yī)生帶來(lái)困擾：它注射后吸收入血過(guò)快且從血液中清除過(guò)快會(huì)導(dǎo)致很大的血藥濃度波動(dòng)，濃度過(guò)高時(shí)會(huì)導(dǎo)致較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，但濃度過(guò)低又會(huì)導(dǎo)致病毒重新復(fù)制和反彈；此外，一旦注射了普通干擾素，它廣泛分布于全身，腎臟清除率很高，也極易被免疫系統(tǒng)識(shí)別其血清半衰期只有2至5小時(shí)，必須頻繁注射用藥，因而干擾素的臨床應(yīng)用受到了很大限制。到1990年代末2000年代之初，聚乙二醇化(PEG)技術(shù)的出現(xiàn)使干擾素終于成為人類與乙肝斗

8、爭(zhēng)中的真正利器。2002年，羅氏研究生產(chǎn)的聚乙二醇化干擾素α-2a(派羅欣)正式上市，聚乙二醇與干擾素的結(jié)合，大大改善了干擾素的藥物特性，使血藥濃度變得更加穩(wěn)定，同時(shí)聚乙二醇分子支鏈對(duì)干擾素有效成分的保護(hù)作用，大大降低了它的抗原性，血清半衰期大大延長(zhǎng)可以每周一次注射用藥臨床療效得以明顯提高，副反應(yīng)顯著減少。,干擾素發(fā)現(xiàn)者Alick Isaacs 　1957年，英國(guó)醫(yī)生Alick Isaacs在進(jìn)行流感病毒試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)雞胚中注射

9、滅活流感病毒后生成了一種物質(zhì)，這種物質(zhì)具有“干擾”流感病毒感染的作用，于是Isaacs將這種物質(zhì)稱之為“interferon”，也就是今天我們所說(shuō)的干擾素。干擾素抗病毒作用機(jī)理的發(fā)現(xiàn)者Robert M.Friedman 在1966到1971年期間，美國(guó)醫(yī)生Robert M.Friedman發(fā)現(xiàn)了干擾素對(duì)病毒的抑制作用主要是干擾素干擾了病毒信使RNA功能，而抑制了蛋白的合成。從此，關(guān)于干擾素抗病毒的作用機(jī)理的深入研究才被逐

10、漸展開(kāi)。干擾素從實(shí)驗(yàn)室到臨床的重要人物Derek C.Burke 美國(guó)病毒學(xué)專家Derek C.Burke致力于干擾素的生產(chǎn)流程的研究，并在1980年實(shí)現(xiàn)了通過(guò)人類白細(xì)胞進(jìn)行干擾素量化生產(chǎn)，雖然這種生產(chǎn)方式無(wú)法與基因技術(shù)出現(xiàn)后的生物工程生產(chǎn)方式相比，但對(duì)干擾素從實(shí)驗(yàn)室成功地走向臨床卻是有著非常重要的意義。干擾素免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的證實(shí)者Samuel Baron 　美國(guó)人Samuel Baron與Isaacs的共同研究證

11、實(shí)了干擾素在機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗病毒感染中的起著非常重要的作用，也正是他們的研究為干擾素在臨床的應(yīng)用提供了更多的證據(jù)，并為干擾素抗病毒的雙重作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。使干擾素的臨床應(yīng)用成為可能Sidney Pestka 　美國(guó)科學(xué)家Sidney Pestka在羅氏研究院里成功克隆出了干擾素cDNA，為后來(lái)干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。,上海生物制品研究所北京三元基因工程有限公司長(zhǎng)春海伯爾生物技術(shù)有限責(zé)任公司深圳科興生物工程有限公司

12、哈藥集團(tuán)生物工程有限公司天津華立達(dá)生物工程有限公司沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司……,二、干擾素生產(chǎn)企業(yè),干擾素在病毒細(xì)胞表面與特殊膜受體結(jié)合發(fā)揮抗DNA和RNA作用，包括對(duì)某些酶的誘導(dǎo)作用，阻止受病毒感染細(xì)胞中病毒的復(fù)制，抑制這些細(xì)胞的繁殖。本品具有免疫調(diào)節(jié)作用，可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的特殊細(xì)胞毒性。1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒，它一般為廣譜病毒抑制劑

13、，對(duì)RNA和DNA病毒都有抑制作用。當(dāng)病毒感染的恢復(fù)期可見(jiàn)干擾素的存在，另一方面用外源性干擾素亦可緩解感染。2.抑制細(xì)胞增殖：干擾素抑制細(xì)胞分裂的活性有明顯的選擇性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的活性比正常細(xì)胞大500～1000倍。干擾素抗腫瘤效果可以是直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，或通過(guò)宿主機(jī)體的免疫防御機(jī)制限制腫瘤的生長(zhǎng)。3.干擾素對(duì)體液免疫、細(xì)胞免疫均有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)巨噬細(xì)胞及NK細(xì)胞也有一定的免疫增強(qiáng)作用。,三、干擾素藥理作用,干擾素防治感冒　干

14、擾素治療非典(SARS)　干擾素治療慢性乙肝(CHB ) 　 干擾素治療腫瘤　干擾素治療皰疹病毒感染　干擾素對(duì)狂犬病毒的作用　干擾素治療亞急性硬化性全腦炎(SSPF ) 干擾素治療多發(fā)性硬化(M S) 及肌萎縮性側(cè)索硬化……,臨床應(yīng)用,1.全身反應(yīng)：主要表現(xiàn)為流感樣癥狀，即寒戰(zhàn)、發(fā)熱和不適。2.骨髓抑制：在用藥中可出現(xiàn)白細(xì)胞、血小板和網(wǎng)狀紅細(xì)胞減少。3.局部反應(yīng)：部分患者在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并有壓痛，24

15、h后即可消退。4.其他：脫發(fā)、皮疹、血沉加快、嗜睡、一過(guò)性肝損傷。偶見(jiàn)過(guò)敏性休克，用藥前應(yīng)做過(guò)敏試驗(yàn)。5.呼吸困難、肝功能降低、白細(xì)胞減少、過(guò)敏反應(yīng)、轉(zhuǎn)氨酶和血肌酐升高、全身乏力、脫發(fā)、鼻塞、鼻出血、上皮萎縮、嗜睡甚至癲癇發(fā)作。6.罕見(jiàn)有抑郁、意識(shí)障礙、體重減輕、皮疹、禿發(fā)、給藥局部反應(yīng)、感覺(jué)異常、呼吸困難、單純皰疹、眼痛、心動(dòng)過(guò)速、焦慮、瘙癢、鼻出血、咳嗽、高血壓、感覺(jué)減退、腹痛、咽炎等。7.心血管系統(tǒng)不良反應(yīng)特別是心律失常似

16、與原有心血管疾病及以前有心臟毒性的治療有關(guān)。劑量大于每天1000萬(wàn)U時(shí)，出現(xiàn)肝功能指標(biāo)AST、ALT上升，粒細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)減少，停藥或減量時(shí)可迅速恢復(fù)。其他尚有白細(xì)胞減少和血清肌酐、LDH、堿性磷酸酯酶上升。,不良反應(yīng),處理好各種不良反應(yīng)，包括必要時(shí)減量、對(duì)癥處理或終止治療。 　?。?）流感樣癥狀的處理：發(fā)熱時(shí)可給予乙酰氨基酚或其他解熱鎮(zhèn)痛藥，干擾素用藥時(shí)機(jī)掌握在就寢前或者傍晚給藥或休息日給藥；多飲水，吃平衡膳食。 　?。?）頭

17、痛的處理：服用鎮(zhèn)痛藥，盡量避免強(qiáng)光和噪聲，不飲酒、少食富含酷氨酸和苯丙氨酸的食物，限制咖啡因的攝入，保證每日足夠睡眠及充足的水分。 　　（3）發(fā)熱、乏力、肌肉疼痛的處理：干擾素注射前口服對(duì)乙棧氨基酚，或其他非處方退熱藥，就寢前或者傍晚給藥，使患者在睡眠中度地發(fā)熱期；冷敷、熱水浸泡或理療、按摩。 　?。?）失眠或興奮的處理：保持良好的睡眠衛(wèi)生習(xí)慣，規(guī)律的作息時(shí)間，睡前保持放松狀態(tài)，有睡意時(shí)才睡覺(jué)，限制午睡時(shí)間；定期進(jìn)行鍛煉，限制咖啡因

18、的乙醇的攝入。 　?。?）脫發(fā)的處理：避免用損發(fā)產(chǎn)品、電吹風(fēng)機(jī)、束發(fā)帶和每日洗發(fā)；使用柔和的洗發(fā)劑和護(hù)發(fā)劑；避免染發(fā)和燙發(fā)，留短發(fā)或者戴假發(fā)。 　?。?）食欲減退的處理：保持良好的口腔衛(wèi)生，適當(dāng)?shù)男菹⒑湾憻?；少量多餐，多食水果、蔬菜?　?。?）注射局部反應(yīng)的處理：注射前冰敷注射部位至產(chǎn)生麻木感；注射部位消毒，待乙醇干燥后再注射；藥物達(dá)到室溫后注射，以45°~90°進(jìn)針；不要搓揉注射部位；交替部位注射。 　　

19、（8）抑郁癥的處理：治前評(píng)估心理健康穩(wěn)定性，預(yù)測(cè)治療期間癥狀的強(qiáng)度，根據(jù)抑郁的嚴(yán)重程度，調(diào)整干擾素劑量或停止治療，需要時(shí)可以酌情給予抗抑郁藥。 　　（9）甲亢的處理：暫停干擾素治療，適當(dāng)給予甲亢藥物治療，疾病穩(wěn)定后可謹(jǐn)慎繼續(xù)治療。,如何應(yīng)對(duì)干擾素的不良反應(yīng),體外誘生干擾素制備工藝： Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準(zhǔn)上市存在問(wèn)題：產(chǎn)量低：1g IFNα，需要 3億ml人血白細(xì)胞，來(lái)源困難

20、，工藝復(fù)雜，收率低，價(jià)格昂貴，潛在的血源性病毒污染的可能性,四、干擾素的制備路線,干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）,人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝： 1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批準(zhǔn)用于臨床。 優(yōu)點(diǎn)：首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。 缺點(diǎn)： 活性低，退出臨床應(yīng)用。,干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）,基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 199

21、0，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化，N-met，無(wú)活性包涵體 工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過(guò)程，隨后變性、復(fù)性過(guò)程。,干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）,動(dòng)物無(wú)限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：上市產(chǎn)品：rhuIFN β-1a1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono)表達(dá)產(chǎn)物：166 aa 糖基化

22、蛋白，22.5 ku工藝特點(diǎn)：細(xì)胞培養(yǎng)，分泌表達(dá)缺點(diǎn)：產(chǎn)量低，成本高,過(guò)程嚴(yán)格,干擾素生產(chǎn)工藝路線（4）,?宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonas putida）?上市產(chǎn)品：IFN α-2b/安福隆?表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子 結(jié)構(gòu)和生物活性?工藝特點(diǎn)：發(fā)酵周期短（幾個(gè)小時(shí)），無(wú)需變性、復(fù)性過(guò)程，獲得有活性產(chǎn)品，純化過(guò)程：淘汰抗體親和層析,干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）,

23、基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝,我們生活的環(huán)境是被微生物包圍著的，時(shí)時(shí)刻刻都要接觸到許多微生物，其中病毒的侵染刺激也不少?？茖W(xué)家猜測(cè)，人的血液細(xì)胞里本身就存在干擾素。后來(lái)研究證明，這種猜測(cè)是有道理的，通過(guò)精密的血液分析，在人和許多動(dòng)物的細(xì)胞中都找到了干擾素。 　　人們最初想到的是，通過(guò)血液制取干擾素?？上?，干擾素在血液中的含量實(shí)在是太少了，用大量的血液才能制得微量的干擾素，這種生產(chǎn)方式產(chǎn)量低得可憐，自然價(jià)格也就十分昂貴。治療一個(gè)病人的

24、費(fèi)用高達(dá)幾萬(wàn)美元，一般百姓只能望“藥”興嘆，是名副其實(shí)的“貴族藥”，干擾素?zé)o法得到普及、推廣。 　　既然蛋白質(zhì)是干擾素的本質(zhì)，那么把制造成這種蛋白質(zhì)的遺傳基因找出來(lái)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，讓它們代勞進(jìn)行大量生產(chǎn)，也許能行。經(jīng)過(guò)科學(xué)家的試驗(yàn)，干擾素的批量生產(chǎn)便成為可能。1980年，終于實(shí)現(xiàn)了干擾素的批量生產(chǎn)，這是美國(guó)科學(xué)家的杰作，他們利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了生產(chǎn)干擾素的基因工程。 　　如今，運(yùn)用基因工程技術(shù)的國(guó)家有：美國(guó)、日本、法國(guó)、比利

25、時(shí)、德國(guó)、英國(guó)以及中國(guó)等。通過(guò)DNA重組、大腸桿菌發(fā)酵等方法，大量獲取各種干擾素。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)明，這樣制得的干擾素對(duì)乙型肝炎、狂犬病、呼吸道發(fā)炎、腦炎等多種傳染病的病毒都有一定療效。干擾素能減緩癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，是很有希望的防癌治癌藥物，具有非常誘人的前影。,病毒的克星——干擾素！,干擾素是一種很時(shí)髦的新藥。據(jù)報(bào)道，干擾素越來(lái)越神奇了，開(kāi)始還只是治愈一些流感、肝炎、水痘之類的小毛病，現(xiàn)在對(duì)付許多腫瘤、癌癥還有白血病都用上了干擾素。不但如此，由于