通絡(luò)方劑、褪黑素和硫辛酸對(duì)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的影響及對(duì)糖尿病腎病保護(hù)作用的研究.pdf

1、通絡(luò)方劑、褪黑素和硫辛酸對(duì)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的影響及對(duì)糖尿病腎病保護(hù)作用的研究。 研究目的：糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetesmellitu，DM)常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，在歐美等國(guó)家是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renaldisease，ESRD)的常見(jiàn)病因。糖尿病腎病早期的病理特征是。腎小球和腎小管細(xì)胞肥大伴基底膜增厚，臨床表現(xiàn)為高濾過(guò)和微量蛋白尿。糖尿病腎病

2、進(jìn)展導(dǎo)致腎小球系膜基質(zhì)增加，促進(jìn)腎小球硬化和腎小球間質(zhì)纖維化，進(jìn)而腎小球功能喪失并最終導(dǎo)致終末期腎病。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)高糖可刺激氧自由基(Reactive oxygenspecies，ROS)的增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，激活多元醇、晚期糖化終末產(chǎn)物，蛋白激酶C和已糖胺4大代謝通路，而這4條通路激活又導(dǎo)致ROS增加，形成惡性循環(huán)，損傷靶器官，因此認(rèn)為氧化應(yīng)激是糖尿病腎病的發(fā)病基礎(chǔ)。同時(shí)，高糖誘導(dǎo)腎內(nèi)腎素.血管緊張素系統(tǒng)(renin-ang

3、iotensin system，RAS)激活，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，過(guò)多ROS進(jìn)一步激活RAS，RAS阻斷藥物在糖尿病腎病治療中所獲得的益處也充分證實(shí)RAS激活是糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制之一。隨著氧化應(yīng)激和RAS激活在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)理中的作用日益受到關(guān)注，抗氧化治療和RAS的阻斷對(duì)糖尿病腎病是否有防治作用成為近期研究的熱點(diǎn)。褪黑素(Mel)與a-硫辛酸(LA)作為強(qiáng)抗氧化劑，具有清除氧自由基、提高抗氧化酶的活性等作用；中藥制劑通絡(luò)方劑具有活血、通絡(luò)

4、、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)皮的功能。本課題運(yùn)用血生化指標(biāo)檢驗(yàn)、形態(tài)學(xué)檢查、放射免疫分析和Real-time PCR等多種實(shí)驗(yàn)方法從生化水平和分子生物學(xué)水平研究上述藥物對(duì)氧化應(yīng)激和 RAS的影響，探討其對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用和機(jī)制。 研究方法： 1、動(dòng)物模型的建立：3月齡健康雄性SD大鼠(體重約190～215g)共60只，隨機(jī)選7只作為CN組(CN組，n=7)：正常對(duì)照組，剩余SD大鼠用鏈脲佐菌素(STZ 60mg/kg)腹腔注射，3天

5、后測(cè)末梢血糖>16.7 mmol/L為誘導(dǎo)糖尿病(DM)模型成功。誘導(dǎo)糖尿病模型后將大鼠隨機(jī)分組為7組，分別為：A組(DM組，n=9)：糖尿病未治療組，等量的2％乙醇，灌胃；B組(TL1組，n=7)：糖尿病通絡(luò)方劑小劑量治療組，0.5/kg，灌胃；C組(TL2組，n=8)：糖尿病通絡(luò)方劑大劑量治療組，1.0g/kg，灌胃；D組(MT1組，n=7)：糖尿病褪黑素小劑量治療組，0.5mg/kg，灌胃；E組(MT2組，n=7)：糖尿病褪黑素大

6、劑量治療組，10mg/kg，灌胃；G組(TL1+MT1組，n=8)：糖尿病通絡(luò)方劑小劑量0.5g/kg+褪黑素小劑量0.5mg/kg治療組，灌胃；F組(LA組，n=7)：糖尿病a-硫辛酸治療組100mg/kg，灌胃。褪黑素溶于2％乙醇；通絡(luò)方劑為超微顆粒；a-硫辛酸為濃度300mg/12ml，均溶于等量的水；DM組和CN組用等劑量的2％乙醇灌胃。清潔級(jí)飼養(yǎng)，為避免糖尿病大鼠血糖過(guò)高發(fā)生酮癥死亡，根據(jù)每周2次尾靜脈采血測(cè)血糖皮下注射2-4

7、U諾和靈N，自由飲水和攝食。所有組每周2次尾靜脈采血測(cè)定末梢血糖，每周1次測(cè)體重。飼養(yǎng)過(guò)程中共死亡4只：C組、G組各一只，A組2只。 2、糖尿病成模后上述藥物治療10周后處死各組大鼠，分別取動(dòng)脈血4ml用EDTA抗凝，2ml用特殊抗凝(每ml血用0.3M EDTA 20ul，0.32M 二巰基丙醇10ul，8-羥基喹林硫酸鹽20ul抗凝)低溫離心取血漿-20℃保存；取左右腎組織分別稱(chēng)重并記錄，左腎沿冠狀面切開(kāi)，取腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)液

8、氮冷凍后-80℃保存。 3、用自動(dòng)生化儀測(cè)定各組大鼠血糖及血脂指標(biāo)，包括甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。 4、計(jì)算各組大鼠腎重/體重比。 5、用放射免疫分析方法測(cè)定血漿和腎組織均漿中血管緊張素Ⅰ和血管緊張素Ⅱ(A I、A Ⅱ)水平。 6、用Real-time PCR的方法測(cè)定各組大鼠ATlaR mlRNA和AT2R mRNA的改變。 研究的主要結(jié)果

9、： 1、與CN‘組相比，所有STZ誘導(dǎo)的DM組(A-G組)均可見(jiàn)體重明顯下降，同時(shí)血糖明顯升高(P值均<0.001)。DM大鼠這種體重下降除在E組(MT2組)有輕度逆轉(zhuǎn)外(P值<0.05)，其余各藥物組(B、C、D、G、F組)較DM組(A組)體重?zé)o明顯改變(P值均>0.05)；所有DM各藥物治療組(B、C、D、E、G、F組)較DM組(A組)血糖無(wú)明顯改變(P值均>0.05)。CN組與DM組之間除外TC其余血脂指標(biāo)無(wú)明顯差異(P值

10、均>0.05)，藥物治療對(duì)DM組血脂指標(biāo)無(wú)明顯影響(P值均>0.01)。 2、腎重/體重比在DM組較NC組明顯升高(P值均<0.001)，DM各藥物治療組均較DM組有不同程度逆轉(zhuǎn)(P值均<0.01)，并且這種逆轉(zhuǎn)在MT2組(E組)最顯著。 3、放射免疫分析方法檢測(cè)顯示DM組(A組)血漿和腎組織勻漿A Ⅰ、A Ⅱ水平明顯高于CN組(P值均<0.05)，上述指標(biāo)存DM各藥物治療組(B-G組)均較DM組(A組)有不同程度逆轉(zhuǎn)(

11、P值均<0.001)，并在MT2和TL1+MT1組(E組和G組)較顯著。 4、通過(guò)用'Real-timePCR的方法測(cè)定各組大鼠AT1aR mRNA和AT2R mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)大鼠AT1aR mRNA和AT2R mRNA及其AT1aR/AT2R的比值在DM組(A組)均較CN組明顯上調(diào)(P值均<0.001)，且AT1aR mRNA這種上調(diào)改變更顯著(AT1aRmRNA 和 AT2R mRNA表達(dá)量分別較CN組升高約39倍和4倍

12、)。各藥物治療除LA(F組)對(duì)DM上調(diào)的 AT2R mRNA 無(wú)影響(P值>0.05)外，其余各藥物組較DM組AT1aR mRNA和AT2R mRNA均有不同程度減少(P值均<0.001)，而這種對(duì)受體下調(diào)的作用對(duì)．AT1aR mRNA更為顯著。這種下調(diào)改變對(duì)AT1aRmRNA影響在TL1+MT1組(G組)最強(qiáng)；而對(duì)AT2R mRNA影響則在TL2組(C組)最強(qiáng)。各藥物組AT1aR/AT2R均較 DM組降低(P值均<0.01)。

13、 研究結(jié)論： 1、在糖尿病腎病中，高糖激活腎臟的RAS，不依賴(lài)于循環(huán)中RAS的改變而誘導(dǎo)局部的血管緊張素水平升高，并通過(guò)其上調(diào)的AT1aR受體，使AT1aR與AT2R受體的失衡，從而導(dǎo)致腎臟功能損傷； 2、通絡(luò)方劑及抗氧化劑(褪黑素和 a-硫辛酸)均顯示糖尿病腎病的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用并不依賴(lài)于血糖和血脂的改變； 3、中藥制劑通絡(luò)方劑和抗氧化劑(褪黑素和a-硫辛酸)均能對(duì)糖尿病腎臟局部激活的RAS有不同程度的