通絡(luò)方劑、褪黑素和硫辛酸對腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的影響及對糖尿病腎病保護作用的研究.pdf

1、通絡(luò)方劑、褪黑素和硫辛酸對腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的影響及對糖尿病腎病保護作用的研究。 研究目的：糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetesmellitu，DM)常見的慢性并發(fā)癥，在歐美等國家是導致終末期腎病(end-stage renaldisease，ESRD)的常見病因。糖尿病腎病早期的病理特征是。腎小球和腎小管細胞肥大伴基底膜增厚，臨床表現(xiàn)為高濾過和微量蛋白尿。糖尿病腎病

2、進展導致腎小球系膜基質(zhì)增加，促進腎小球硬化和腎小球間質(zhì)纖維化，進而腎小球功能喪失并最終導致終末期腎病。近年來研究發(fā)現(xiàn)高糖可刺激氧自由基(Reactive oxygenspecies，ROS)的增加，導致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，激活多元醇、晚期糖化終末產(chǎn)物，蛋白激酶C和已糖胺4大代謝通路，而這4條通路激活又導致ROS增加，形成惡性循環(huán)，損傷靶器官，因此認為氧化應(yīng)激是糖尿病腎病的發(fā)病基礎(chǔ)。同時，高糖誘導腎內(nèi)腎素.血管緊張素系統(tǒng)(renin-ang

3、iotensin system，RAS)激活，導致氧化應(yīng)激，過多ROS進一步激活RAS，RAS阻斷藥物在糖尿病腎病治療中所獲得的益處也充分證實RAS激活是糖尿病腎病發(fā)病機制之一。隨著氧化應(yīng)激和RAS激活在糖尿病腎病發(fā)病機理中的作用日益受到關(guān)注，抗氧化治療和RAS的阻斷對糖尿病腎病是否有防治作用成為近期研究的熱點。褪黑素(Mel)與a-硫辛酸(LA)作為強抗氧化劑，具有清除氧自由基、提高抗氧化酶的活性等作用；中藥制劑通絡(luò)方劑具有活血、通絡(luò)

4、、穩(wěn)定細胞內(nèi)皮的功能。本課題運用血生化指標檢驗、形態(tài)學檢查、放射免疫分析和Real-time PCR等多種實驗方法從生化水平和分子生物學水平研究上述藥物對氧化應(yīng)激和 RAS的影響，探討其對糖尿病腎病的保護作用和機制。 研究方法： 1、動物模型的建立：3月齡健康雄性SD大鼠(體重約190～215g)共60只，隨機選7只作為CN組(CN組，n=7)：正常對照組，剩余SD大鼠用鏈脲佐菌素(STZ 60mg/kg)腹腔注射，3天

5、后測末梢血糖>16.7 mmol/L為誘導糖尿病(DM)模型成功。誘導糖尿病模型后將大鼠隨機分組為7組，分別為：A組(DM組，n=9)：糖尿病未治療組，等量的2％乙醇，灌胃；B組(TL1組，n=7)：糖尿病通絡(luò)方劑小劑量治療組，0.5/kg，灌胃；C組(TL2組，n=8)：糖尿病通絡(luò)方劑大劑量治療組，1.0g/kg，灌胃；D組(MT1組，n=7)：糖尿病褪黑素小劑量治療組，0.5mg/kg，灌胃；E組(MT2組，n=7)：糖尿病褪黑素大

6、劑量治療組，10mg/kg，灌胃；G組(TL1+MT1組，n=8)：糖尿病通絡(luò)方劑小劑量0.5g/kg+褪黑素小劑量0.5mg/kg治療組，灌胃；F組(LA組，n=7)：糖尿病a-硫辛酸治療組100mg/kg，灌胃。褪黑素溶于2％乙醇；通絡(luò)方劑為超微顆粒；a-硫辛酸為濃度300mg/12ml，均溶于等量的水；DM組和CN組用等劑量的2％乙醇灌胃。清潔級飼養(yǎng)，為避免糖尿病大鼠血糖過高發(fā)生酮癥死亡，根據(jù)每周2次尾靜脈采血測血糖皮下注射2-4

7、U諾和靈N，自由飲水和攝食。所有組每周2次尾靜脈采血測定末梢血糖，每周1次測體重。飼養(yǎng)過程中共死亡4只：C組、G組各一只，A組2只。 2、糖尿病成模后上述藥物治療10周后處死各組大鼠，分別取動脈血4ml用EDTA抗凝，2ml用特殊抗凝(每ml血用0.3M EDTA 20ul，0.32M 二巰基丙醇10ul，8-羥基喹林硫酸鹽20ul抗凝)低溫離心取血漿-20℃保存；取左右腎組織分別稱重并記錄，左腎沿冠狀面切開，取腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)液

8、氮冷凍后-80℃保存。 3、用自動生化儀測定各組大鼠血糖及血脂指標，包括甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。 4、計算各組大鼠腎重/體重比。 5、用放射免疫分析方法測定血漿和腎組織均漿中血管緊張素Ⅰ和血管緊張素Ⅱ(A I、A Ⅱ)水平。 6、用Real-time PCR的方法測定各組大鼠ATlaR mlRNA和AT2R mRNA的改變。 研究的主要結(jié)果

9、： 1、與CN‘組相比，所有STZ誘導的DM組(A-G組)均可見體重明顯下降，同時血糖明顯升高(P值均<0.001)。DM大鼠這種體重下降除在E組(MT2組)有輕度逆轉(zhuǎn)外(P值<0.05)，其余各藥物組(B、C、D、G、F組)較DM組(A組)體重無明顯改變(P值均>0.05)；所有DM各藥物治療組(B、C、D、E、G、F組)較DM組(A組)血糖無明顯改變(P值均>0.05)。CN組與DM組之間除外TC其余血脂指標無明顯差異(P值

10、均>0.05)，藥物治療對DM組血脂指標無明顯影響(P值均>0.01)。 2、腎重/體重比在DM組較NC組明顯升高(P值均<0.001)，DM各藥物治療組均較DM組有不同程度逆轉(zhuǎn)(P值均<0.01)，并且這種逆轉(zhuǎn)在MT2組(E組)最顯著。 3、放射免疫分析方法檢測顯示DM組(A組)血漿和腎組織勻漿A Ⅰ、A Ⅱ水平明顯高于CN組(P值均<0.05)，上述指標存DM各藥物治療組(B-G組)均較DM組(A組)有不同程度逆轉(zhuǎn)(

11、P值均<0.001)，并在MT2和TL1+MT1組(E組和G組)較顯著。 4、通過用'Real-timePCR的方法測定各組大鼠AT1aR mRNA和AT2R mRNA表達量，發(fā)現(xiàn)大鼠AT1aR mRNA和AT2R mRNA及其AT1aR/AT2R的比值在DM組(A組)均較CN組明顯上調(diào)(P值均<0.001)，且AT1aR mRNA這種上調(diào)改變更顯著(AT1aRmRNA 和 AT2R mRNA表達量分別較CN組升高約39倍和4倍

12、)。各藥物治療除LA(F組)對DM上調(diào)的 AT2R mRNA 無影響(P值>0.05)外，其余各藥物組較DM組AT1aR mRNA和AT2R mRNA均有不同程度減少(P值均<0.001)，而這種對受體下調(diào)的作用對．AT1aR mRNA更為顯著。這種下調(diào)改變對AT1aRmRNA影響在TL1+MT1組(G組)最強；而對AT2R mRNA影響則在TL2組(C組)最強。各藥物組AT1aR/AT2R均較 DM組降低(P值均<0.01)。

13、 研究結(jié)論： 1、在糖尿病腎病中，高糖激活腎臟的RAS，不依賴于循環(huán)中RAS的改變而誘導局部的血管緊張素水平升高，并通過其上調(diào)的AT1aR受體，使AT1aR與AT2R受體的失衡，從而導致腎臟功能損傷； 2、通絡(luò)方劑及抗氧化劑(褪黑素和 a-硫辛酸)均顯示糖尿病腎病的保護作用，且這種保護作用并不依賴于血糖和血脂的改變； 3、中藥制劑通絡(luò)方劑和抗氧化劑(褪黑素和a-硫辛酸)均能對糖尿病腎臟局部激活的RAS有不同程度的