降乳顆粒治療高泌乳素血癥和垂體泌乳素瘤的機(jī)理研究.pdf

1、目的：
　　 高泌乳素血癥(Hyperprolactinemia，HPRL)指由各種致病因素引起的，以外周血清泌乳素(Prolactin，PRL)升高(≥25ng/ml)，以閉經(jīng)、溢乳為特征的綜合征。PRL作為垂體前葉唯一受下丘腦抑制性調(diào)控的激素，與垂體泌乳素瘤的關(guān)系十分密切。垂體泌乳素瘤是高泌乳素血癥最常見的原因，約占垂體腺瘤的40％—60％。自Hwang等(1971年)首先報(bào)道泌乳素放射免疫分析法(RIA)，可以測定泌乳素，

2、以及CT及MRI檢查逐步廣泛應(yīng)用于臨床，使垂體泌乳素腺瘤的發(fā)現(xiàn)率大為提高。其臨床癥狀以泌乳停經(jīng)為主，血清泌乳素(PRL)增高，雌激素減少為主要診斷指標(biāo)。典型臨床表現(xiàn)：女性為閉經(jīng)、泌乳、不孕；男性為陽痿，性功能減退，乳房發(fā)育；腫瘤壓迫及侵犯周圍結(jié)構(gòu)所引起一系列癥狀和體征。
　　 常用的治療方法有藥物、手術(shù)、放療等，其共同的治療目的是使腺瘤縮小、PRL水平恢復(fù)正常、恢復(fù)垂體正常功能和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。泌乳素微腺瘤目前的治療方法主要有藥物

3、、手術(shù)、放射治療，但手術(shù)有一定的并發(fā)癥，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。所以，藥物治療近來被提到更加重要的位置。藥物主要有溴隱亭和卡麥角林，自從20世紀(jì)70年代溴隱亭首次被合成應(yīng)用于臨床，依賴藥物治療已成為目前泌乳素腺瘤的主要治療方法和首選治療方案。溴隱亭能興奮垂體多巴胺D2受體，從而抑制PRL分泌，可有效地降低80％-90％的患者PRL水平，縮小或控制腫瘤生長，但有的患者不能耐受溴隱亭的副作用。而且溴隱亭價(jià)格較責(zé)，停藥易復(fù)發(fā)，患者往往不能堅(jiān)持服藥，導(dǎo)

4、致治療受到限制。
　　 因此，如何挖掘運(yùn)用中醫(yī)中藥治療本病的有效方法，成為普遍關(guān)注的問題。近年來，眾多臨床工作者運(yùn)用中醫(yī)理論研究、探討本病的病因病機(jī)、治療方法、作用機(jī)制等，在這一領(lǐng)域取得了可喜的成果。實(shí)踐證明，我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥對(duì)高泌乳素血癥及垂體泌乳素瘤有一定療效。為探索其藥理學(xué)意義和治療機(jī)理，我們根據(jù)導(dǎo)師許芝銀教授長期臨床經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合祖國醫(yī)學(xué)對(duì)本病相關(guān)癥狀的認(rèn)識(shí)，選取健脾養(yǎng)肝溫腎的中藥，制成降乳顆粒(生麥芽、生白芍、仙靈脾)，并有

5、與溴隱亭比較，取得了較好的治療效果。對(duì)滅吐靈造成小鼠高泌乳素血癥模型和乙烯雌酚所致大鼠垂體泌乳素瘤的抑制作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，為臨床應(yīng)用中醫(yī)中藥治療本病提供較為翔實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為治療本病的中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究提供新的思路，希望為臨床提供新的治療藥物。
　　 方法：
　　 1.降乳顆粒主要藥效學(xué)研究
　　 1.1降乳顆粒對(duì)高泌乳素血癥小鼠的影響
　　 昆明種雌性小鼠皮下注射滅吐靈，劑量24mg/kg，每天3次，連

6、續(xù)4天。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示造模4天后血泌乳素明顯升高。
　　 小鼠造模成功后，按血清泌乳素高低隨機(jī)分為6組，即：(1)正常組：給予等體積蒸餾水；(2)模型組：給予等體積蒸餾水；(3)降乳顆粒高劑量組：給予降乳顆粒10g生藥/kg體重；(4)降乳顆粒中劑量組：給予降乳顆粒5g生藥/kg體重；(5))降乳顆粒低劑量組：給予降乳顆粒2.5g生藥/kg體重；(6)陽性對(duì)照組：給予溴隱亭2mg/kg體重。觀察指標(biāo)：(1)血清PRL、T、FSH

7、和LH：按試劑盒說明書采用放免法測定。(2)子宮重量。處死小鼠，分離子宮，精密稱重，計(jì)算子宮指數(shù)。
　　 1.2對(duì)乙烯雌酚所致大鼠泌乳素瘤的抑制作用
　　 成年雄性Wistar大鼠，分為兩組，PRL瘤組，于其背部中線尾骨上約3cm偏左處作一約1cm長縱形切口，游離皮下組織，將一含有乙烯雌酚(DES)20mg的硅膠管(長2cm，內(nèi)徑1.5mm，外徑2.41mm)植入皮下；空白對(duì)照組皮下植入空白硅膠管。埋管8周后，兩組各處死

8、5只動(dòng)物，檢測造模成功。將PRL瘤組剩余動(dòng)物的硅膠管取出，然后隨機(jī)分組。
　　 按血清泌乳素高低隨機(jī)分為6組，即：(1)正常組：給予等體積蒸餾水；(2)模型組：給予等體積蒸餾水；(3)降乳顆粒高劑量組：給予降乳顆粒10g生藥/kg體重；(4)降乳顆粒中劑量組：給予降乳顆粒5g生藥/kg體重；(5)降乳顆粒低劑量組：給予降乳顆粒2.5g生藥/kg體重；(6)陽性對(duì)照組：給予溴隱停0.5mg/kg體重。連續(xù)給藥4周。觀察指標(biāo)(1)大

9、鼠體重增長：每周記錄體重1次(2)垂體重量。處死大鼠，分離垂體，精密稱重，計(jì)算垂體指數(shù)。(3)血清PRL水平的放免測定(4)血清性激素：采用放免法測定；(5)垂體病理組織學(xué)檢查。
　　 2.降乳顆粒治療泌乳素瘤機(jī)理研究
　　 2.1對(duì)乙烯雌酚誘發(fā)的大鼠泌乳素瘤垂體組織中腫瘤轉(zhuǎn)化基因的影響
　　 造模同1.2。按血清泌乳素高低隨機(jī)分為4組，即：(1)正常組：給予等體積蒸餾水；(2)模型組：給予等體積蒸餾水；(3)降

10、乳顆粒組：給予降乳顆粒5g生藥/kg體重；(4)陽性對(duì)照組：給予溴隱停0.5mg/kg體重。連續(xù)給藥4周。用RT—PCR方法分析大鼠垂體組織中腫瘤轉(zhuǎn)化基因(PTTG)的表達(dá)量。
　　 2.2對(duì)垂體泌乳素瘤垂體體外培養(yǎng)和激素分泌的影響
　　 造模同2.1。大鼠含藥血清的制備及滅活：取雄性SD大鼠，隨機(jī)分為5組，即：(1)空白對(duì)照組：給予等量生理鹽水；(2)降乳顆粒高劑量組：給予降乳顆粒10g生藥/kg體重；(3)降乳顆粒中

11、劑量組：給予降乳顆粒5g生藥/kg體重；(4)降乳顆粒低劑量組：給予降乳顆粒2.5g生藥/kg體重；(5)西藥對(duì)照組：給予溴隱停1mg/kg體重。各組均灌胃給藥，給藥體積為10ml/kg體重。每日給藥1次，連續(xù)給藥5天。頸動(dòng)脈取血。將各組血液置于4℃放置4h，3000rpm離心10min，取上清液，經(jīng)0.22um濾器抽濾除菌，同組混勻，經(jīng)56℃，滅活30min后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.3垂體腺瘤細(xì)胞分離及培養(yǎng)

12、　　 垂體分組：垂體共分為6組，每組8孔。(1)正常組：為正常大鼠垂體，培養(yǎng)液中加正常大鼠血清(2)模型組：培養(yǎng)液中加正常大鼠血清。(3)降乳顆粒高劑量組：培養(yǎng)液中加高劑量組大鼠血清。(4)降乳顆粒中劑量組：培養(yǎng)液中加中劑量組大鼠血清。(5)降乳顆粒低劑量組：培養(yǎng)液中加低劑量組大鼠血清。(6)溴隱停組：培養(yǎng)液中加溴隱停組大鼠血清。
　　 垂體腺瘤細(xì)胞分離及培養(yǎng)：造模大鼠脫頸椎處死后，取垂體前葉，置1640培養(yǎng)液中洗滌3次，將每

13、個(gè)垂體組織對(duì)切成2個(gè)組織塊，置24孔培養(yǎng)板中(每孔一塊)。每孔加1m l1640培養(yǎng)液(不含血清，下同)，CO2培養(yǎng)箱中(37℃，5％CO2預(yù)培養(yǎng)3h后，吸棄培養(yǎng)液，再加1m l1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)2h，作為基礎(chǔ)培養(yǎng)(BasalCulture)。培養(yǎng)結(jié)束后，吸取培養(yǎng)液至冷凍管，-20℃保存待測。垂體組織塊每孔加入1m l含有各種濃度藥物的1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6h，作為藥物培養(yǎng)(DrugExpoure Culture)。培養(yǎng)結(jié)束后，收

14、集培養(yǎng)液至冷凍管中，-20℃保存待測。每組培養(yǎng)8孔。
　　 2.4垂體體外培養(yǎng)液中血清激素測定
　　 結(jié)果：
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明，(1)降乳顆粒各劑量組小鼠血清PRL均低于模型組，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。(2)降乳顆粒各劑量組小鼠子宮指數(shù)均高于模型組，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。(3)降乳顆粒高、中劑量組大

15、鼠血清LH、FSH和E2水平均高于模型組，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。(4)降乳顆粒各劑量組大鼠垂體指數(shù)均低于模型組，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。(5)降乳顆粒高、中劑量組大鼠血清PRL水平低于模型組，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。(6)降乳顆粒高劑量組大鼠血清T水平低于模型組，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.05)。降乳顆粒高、中劑量組大鼠血清LH、FSH和E2水平均高于模型組

16、，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。(7)垂體病理組織學(xué)檢查示降乳顆粒高劑量組具有抑制垂體細(xì)胞增生，垂體病變?cè)u(píng)分：降乳顆粒高劑量組大鼠垂體每組平均細(xì)胞數(shù)低于模型組，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.05)。(8)降乳顆粒中大鼠垂體組織中PTTG mRNA表達(dá)量低于模型組，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。(9)降乳顆粒高、中低劑量組培養(yǎng)液中PRI，含量低于模型組，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.01)。