麥芽治療高泌乳素血癥有效部位篩選及其作用機制研究.pdf

1、目的：
　　本研究在前期試驗基礎上，繼續(xù)研究麥芽中總生物堿物質(zhì)的提取純化工藝。利用現(xiàn)代化藥理學研究方法，復制高泌乳素血癥動物疾病模型，對麥芽不同極性部位和不同化學部位，以及純化后生物堿物質(zhì)開展藥效學試驗，篩選出麥芽治療HPRL有效部位，并闡明其作用機制。
　　方法：
　　（一）稱取適量麥芽用70％乙醇回流提取浸膏，加水溶解制成混懸液后依次加入石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取得到不同極性部位提取物，再對各個部位中的化學成分進

2、行含量測定。根據(jù)相關文獻，選擇水做溶劑，40℃水浴，提取得到麥芽總多糖粗提物；用70%乙醇回流提取，然后通過聚酰胺樹脂柱進行簡單的純化，得到麥芽總黃酮粗提物；用70%乙醇超聲提取，然后通過HPD-600大孔樹脂柱進行簡單的純化，得到麥芽總酚粗提物。麥芽總生物堿粗提物制備和含量測定方法依據(jù)本課題組前期的實驗方法進行。
　?。ǘ└鶕?jù)單因素實驗選擇麥芽中生物堿物質(zhì)的提取溶劑，再進行正交試驗，以總生物堿和大麥芽堿提取量的綜合評分為評價指

3、標，優(yōu)選出麥芽生物堿物質(zhì)的最佳提取工藝。再以總生物堿的轉移率和純度為評價指標，比較柱層析法和溶劑萃取法對麥芽總生物堿的純化效果，同時對溶劑萃取法中脫脂溶劑、水浴溫度以及氨水堿化溶液至不同PH值進行考察，優(yōu)選麥芽總生物堿的最佳純化工藝。
　?。ㄈ└呙谌樗匮Y模型的建立：除正常組大鼠外，其它各組大鼠背部皮下注射鹽酸甲氧氯普胺注射液50mg/kg體重，每天上午下午分別定時注射1次，連續(xù)5天。
　　分組給藥：將120只雌性未孕SD

4、大鼠隨機分為12組：正常組、模型組、石油醚和乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組、水部位組、原藥材水提物組、總生物堿粗提部位組、總多糖粗提部位組、總黃酮粗提部位組、總酚粗提部位組、生物堿低濃度組、生物堿高濃度組，每組10只。模型制備后開始給藥，石油醚和乙酸乙酯部位組給藥劑量為114.70mg·kg-1·d-1；正丁醇部位組給藥劑量為124.17mg·kg-1·d-1；水部位組給藥劑量為645.96 mg·kg-1·d-1；原藥材水提物組給藥劑量

5、為4.74g·kg-1·d-1；總生物堿粗提部位組給藥劑量為592.43mg·kg-1·d-1；總多糖粗提部位組給藥劑量為1.57g·kg-1·d-1；總黃酮粗提部位組給藥劑量為57.83mg·kg-1·d-1；總酚粗提部位組給藥劑量為103.39mg·kg-1·d-1；生物堿低濃度組給藥劑量為0.87 mg·kg-1·d-1；生物堿高濃度組給藥劑量為1.74 mg·kg-1·d-1。正常組和模型組給予等容量的蒸餾水，連續(xù)灌胃30d。<

6、br>　　對高泌乳素血癥大鼠血清激素含量的檢測：末次給藥24h后，所有大鼠禁食12小時，自由飲水。各組大鼠于次日上午心臟取血2ml，血液靜置后以3000轉/min的速度離心5min，取血清供檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定各組大鼠血清中泌乳素（PRL）、雌激素（E2）、孕酮（P）的含量，嚴格按照ELISA試劑盒說明書中操作流程進行。
　　對高泌乳素血癥大鼠腦垂體泌乳素陽性細胞含量及mRNA表達的影響：正常組、模型組、總生物堿粗提部位組

7、、總多糖粗提部位組、總黃酮粗提部位組、總酚粗提部位組、生物堿低濃度組和生物堿高濃度組大鼠末次給藥24h后，于次日上午用20%烏拉坦麻醉后取其腦垂體。取1/2大鼠腦垂體于組織固定液中充分固定24小時，石蠟包埋切片后，進行免疫組化實驗，測定PRL細胞陽性的累積光密度值（IOD）。取另外的1/2大鼠腦垂體進行PRL mRNA熒光定量PCR實驗，計算擴張倍數(shù)，進行統(tǒng)計學分析。
　　對高泌乳素血癥大鼠乳腺增生情況的影響實驗：正常組、模型組、

8、原藥材組水提物組、總生物堿粗提部位組、總多糖粗提部位組、總黃酮粗提部位組、總酚粗提部位組、生物堿低濃度組和生物堿高濃度組大鼠末次給藥24h后，于次日上午用20%烏拉坦麻醉后取其第二對乳腺組織，于4%多聚甲醛組織固定液中充分固定24小時后，包埋，切片進行HE染色，在顯微鏡下觀察各組大鼠乳腺組織情況，包括乳腺小葉腺泡數(shù)、導管的形狀及上皮細胞數(shù)、腺泡和導管內(nèi)有無分泌物。
　　結果：
　　（一）水部位中得到的浸膏量最多，其次是正丁醇

9、部位，總生物堿物質(zhì)集中存在于正丁醇和水部位中，總黃酮物質(zhì)主要在石油醚和乙酸乙酯部位中含量最高，三個不同極性部位中總酚物質(zhì)含量差異不大。提取到的總多糖粗提物中總多糖的含量達到了98.09%，總黃酮粗提物中總黃酮的含量為9.83%，總酚粗提物中總酚的含量為4.84%。
　?。ǘ﹥?yōu)選出總生物堿的提取純化工藝為：稱取麥芽粗粉，加入5倍量80%甲醇，超聲提取3次，每次提取45 min，收集濾液濃縮蒸干后用PH1~2的HCl水溶液溶解，過濾

10、，濾液中加入3倍量石油醚萃取3次，收集水層溶液用濃氨水調(diào)溶液PH=11，在冰箱中靜置，收集沉淀，沉淀用PH=11的氨水溶液洗滌數(shù)次后棄去，合并濾液于分液漏斗中，加入3倍量的氯仿萃取5次，1h/次，合并氯仿層溶液于60℃水浴蒸干溶劑，用0.03%HCl水溶液溶解，濾過，即得總生物堿部位純度為56.64%。不同產(chǎn)地生麥芽中生物堿物質(zhì)含量相差較大，安徽亳州產(chǎn)的生麥芽中生物堿物質(zhì)含量最高，生大麥中不含大麥芽堿，炒麥芽中生物堿物質(zhì)的含量比生麥芽要

11、低。
　?。ㄈρ逯蠵RL含量的影響：與正常組（4.714±5.159 pg?ml-1）比較，模型組大鼠血清中PRL的含量明顯升高（30.404±5.516 pg?ml-1， P<0.01）；與模型組比較，不同極性部位組大鼠血清中PRL的含量均有所降低，僅總生物堿粗提部位組有顯著性差異（11.051±5.516pg?ml-1， P<0.01），該組大鼠血清中PRL的含量最低接近正常組大鼠血清中PRL的含量。與模型組比較，總生物

12、堿粗提部位組、生物堿低濃度組（11.571±4.263 pg?ml-1）和生物堿高濃度組（7.004±4.044 pg?ml-1）均有極顯著性差異（P<0.01），其中生物堿高濃度組大鼠血清中PRL的含量最低接近正常值。
　　對血清中P含量的影響：不同極性部位比較可知，與正常組（1.283±0.116 ng?ml-1）相比較，模型組大鼠血清中P的含量明顯升高（1.993±0.116 ng?ml-1，P<0.01）；與模型組比較，石

13、油醚和乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組以及水部位組大鼠血清中P的含量均有升高。原藥材水提物組和總生物堿粗提部位組大鼠血清中P的含量均有降低，其中總生物堿粗提部位組有極顯著性差異（1.46±0.135ng?ml-1，P<0.01）。不同化學部位比較可知，與模型組比較，各組大鼠血清中P的含量均有所降低，且相差不大。其中總生物堿粗提部位組、總多糖粗提部位組、總黃酮粗提部位組、總酚粗提部位組和生物堿高濃度組有極顯著性差異。
　　對血清中E2含

14、量的影響：不同極性部位比較可知，與正常組（69.919±5.986 pg?ml-1）相比較，模型組大鼠血清中E2的含量明顯升高（100.825±5.986 pg?ml-1，P<0.01）；與模型組比較，原藥材水提物組（68.949±6.309 pg?ml-1）和總生物堿粗提部位組（64.550±5.986 pg?ml-1）有顯著性降低（P<0.01），其余各組均無顯著性差異。不同化學部位比較可知，與模型組比較，各組大鼠血清中E2的含量均

15、有所降低。
　　泌乳素陽性染色于胞漿中，呈棕黃色。泌乳素細胞的累積光密度值越大表明陽性反應越大。與正常組（0.0068±0.0016）比較，模型組有顯著性差異（0.0553±0.0172，P<0.05），且泌乳素細胞的單位面積平均光密度值明顯高于正常組。與模型組比較，總生物堿粗提部位組（0.0097±0.0026）、生物堿低濃度組（0.0087±0.0028）和生物堿高濃度組（0.0070±0.0019）均有顯著性差異（P<0.0

16、5），總生物堿粗提部位組泌乳素細胞的陽性反應比其他三個化學部位要小，但比生物堿高濃度組要大。
　　PRL mRNA在各組大鼠腦垂體組織中都有表達，與正常組（6.23±1.12）比較，模型組有顯著性差異（22.11±3.86，P<0.05）。與模型組比較，總生物堿粗提部位組（5.95±1.07）、生物堿低濃度組（6.14±1.36）和生物堿高濃度組（4.32±1.08）均有顯著性差異（P<0.05），PRL mRNA的表達水平明顯低

17、于模型組。
　　正常組大鼠乳腺組織中小葉不增生，腺泡少，導管不擴張，無分泌物，為0級增生。模型組大鼠乳腺組織小葉腺泡部分增生，導管擴張，無分泌物，為二級增生，表明高泌乳素血癥伴隨乳腺增生?？偵飰A粗提部位組、總黃酮粗提部位組和總酚粗提部位組大鼠乳腺組織中小葉個別腺泡增生， 導管不擴張，無分泌物，為一級增生。生物堿高濃度組大鼠乳腺組織中小葉不增生，腺泡少，導管不擴張，無分泌物，為0級增生。
　　結論：
　?。ㄒ?/p>

18、）結果顯示麥芽中生物堿物質(zhì)含量較低，傳統(tǒng)水提方法無法將其大量提取出，為中醫(yī)臨床大劑量使用麥芽回乳的用法找到了物質(zhì)基礎依據(jù)。
　?。ǘ﹥?yōu)選后的純化方法可獲得純度大于50%的麥芽總生物堿部位，為藥效學實驗及化學成分分析研究提供了符合要求的樣品。
　?。ㄈ┐_證了麥芽治療高泌乳素血癥的藥效物質(zhì)為其所含生物堿，作用機制是通過減少大鼠腦垂體PRL陽性細胞數(shù)量，下調(diào)腦垂體PRL細胞mRNA的表達，從而降低了大鼠體內(nèi)PRL含量，達到治療