一種高效促進(jìn)血小板生成的全新型融合蛋白SCF-TPO的分子設(shè)計(jì)及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、一種高效促進(jìn)血小板生成的全新型融合蛋白SCF-TPO的分子設(shè)計(jì)及其生物學(xué)活性研究博士后劉楠導(dǎo)師奚永志教授中文摘要血小板減少癥不僅是惡性血液病(如白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤等)誘導(dǎo)緩解、鞏固和加強(qiáng)化療階段的主要并發(fā)癥，也是實(shí)體瘤及其它影響造血細(xì)胞疾病患者放化療過(guò)程常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥。血小板減少癥的出現(xiàn)不僅增加了患者出血、感染引起的相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)，也由此限制了使用細(xì)胞毒性化療藥物的最大殺傷劑量。對(duì)肺癌、乳腺癌及卵巢癌等實(shí)體瘤有特效的新化療藥g

2、emcitabine治療過(guò)程中出現(xiàn)的血小板減少癥限制了該藥物的臨床有效應(yīng)用。同時(shí)，血小板減少癥也是骨髓增生異常綜合征(MDS)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、愛(ài)滋病(AIDS)及慢性肝病等疾病治療過(guò)程中常見(jiàn)并發(fā)癥，這類(lèi)疾病出現(xiàn)的慢性血小板減少癥起因?yàn)檠“迳扇毕莼驕p少、免疫或非免疫性血小板破壞增強(qiáng)，另外進(jìn)行肝移植、心血管手術(shù)等患者也常伴發(fā)血小板減少癥，最終引起患者死亡率增加。有關(guān)血小板減少癥的治療始終是世界性醫(yī)學(xué)難題。 目

3、前臨床上治療嚴(yán)重血小板減少癥的唯一方法是血小板輸注。盡管輸注血小板可以暫時(shí)緩解化放療所致血小板減少引起的嚴(yán)重出血等并發(fā)癥，但多次反復(fù)輸注血小板增加了疾病傳播機(jī)會(huì)、發(fā)熱、同源免疫反應(yīng)及移植物抗宿主病等不良反應(yīng)，也增加了患者住院費(fèi)用及輸注帶來(lái)的不適感。而且，社會(huì)上有限的供血來(lái)源也制約著血小板輸注。再者，臨床上為達(dá)到較為徹底地殺滅殘留白血病或其它腫瘤細(xì)胞而越來(lái)越多使用的多藥物、高劑量聯(lián)合化療方案和造血干細(xì)胞移植以及強(qiáng)支持治療也增加了對(duì)血小板成

4、分輸血的需求。因此，為緩解血小板輸注的供需矛盾并降低血小板輸注的治療費(fèi)用，以及減少血小板輸注引起的不必要的諸多不利因素，努力尋找一種有效促進(jìn)血小板生成劑，從而徹底改變臨床上化放療引起的嚴(yán)重血小板減少癥，已顯得十分迫切和必要。TPO和SCF的克隆成功為解決這一醫(yī)學(xué)難題帶來(lái)了希望。 細(xì)胞因子是由造血系統(tǒng)產(chǎn)生的一種高活性的蛋白質(zhì)或多肽，通過(guò)與其細(xì)胞表面相應(yīng)的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)相應(yīng)靶細(xì)胞的增殖、分化及其靶細(xì)胞介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)過(guò)程從而參與機(jī)體

5、造血調(diào)控、免疫應(yīng)答等生理及病理過(guò)程。利用細(xì)胞因子的這一特性，憑借基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)將兩種細(xì)胞因子構(gòu)建成融合細(xì)胞因子，使之即具有單個(gè)細(xì)胞因子的生物活性，也可通過(guò)生物活性的互補(bǔ)及協(xié)調(diào)效應(yīng)發(fā)揮出較單一細(xì)胞因子更佳的生物學(xué)活性，而同時(shí)又可避免兩種細(xì)胞因子單獨(dú)發(fā)揮作用時(shí)因高劑量使用出現(xiàn)的毒副作用，從而為細(xì)胞因子的理論研究和臨床應(yīng)用提供新的方法。迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者經(jīng)過(guò)不懈的努力構(gòu)建了許多的細(xì)胞因子融合蛋白，比較成功細(xì)胞因子如MEN110

6、3(GM-CSF/EPO)，PIX321(GM-CSF/IL-3)和IL-3/EPO已進(jìn)入了Ⅰ/Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)，表現(xiàn)出較好的生物學(xué)功能和良好的臨床應(yīng)用前景?？梢詳嘌裕?xì)胞因子融合蛋白是當(dāng)今免疫學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱門(mén)問(wèn)題。 人類(lèi)TPO基因定位于3號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)6帶或7帶(3q26，27)，含5個(gè)編碼的外顯子，編碼產(chǎn)物為335個(gè)氨基酸，包括前面21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，分子量為70KD。TPO結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)特征性結(jié)構(gòu)：氨基端受體結(jié)合區(qū)和

7、羧基端TPO糖基化區(qū)，其中154氨基酸長(zhǎng)度的氨基端與人EPO氨基端有23％的序列同源性，與IFN較少同源，該區(qū)是TPO的功能區(qū)，主要起結(jié)合受體、信號(hào)傳導(dǎo)和支持細(xì)胞增殖作用；羧基端區(qū)(153-332)約占70KDTPO的一半，與其他已知的蛋白無(wú)同源性，但富含絲，蘇和脯氨酸，主要增強(qiáng)TPO的穩(wěn)定性。TPO在Cys7-Cys151和Cys29-Cys85有兩個(gè)與其生物學(xué)功能有密切關(guān)系的二硫鍵。TPO是巨核細(xì)胞成熟的主要調(diào)節(jié)子，能誘導(dǎo)巨核系祖細(xì)

8、胞的增殖；TPO也能支持造血干細(xì)胞的存活，與IL-3，SCF和GM-CSF協(xié)同誘導(dǎo)造血干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)并增加原始和分化造血祖細(xì)胞數(shù)量。干細(xì)胞因子(SCF)，又稱(chēng)c-kit配體，是一個(gè)作用于較原始和成熟祖細(xì)胞的造血生長(zhǎng)因子，其基因定位于12號(hào)染色體，含有8個(gè)外顯子，基因長(zhǎng)50kb。由于外顯子6處的剪切，SCF可有兩種形式：SCF248和SCF220(膜結(jié)合型)。SCF248在Ala165位有一個(gè)特殊的蛋白裂解位點(diǎn)，產(chǎn)生由胞外區(qū)165氨基

9、酸組成的可溶型SCF；SCF220缺乏此裂解位點(diǎn)，由157氨基酸胞外區(qū)，27氨基酸跨膜區(qū)和36氨基酸胞漿區(qū)組成。兩種形式的SCF都具有生物學(xué)活性，都能促進(jìn)祖細(xì)胞的存活，與其它造血細(xì)胞因子如GM-CSF，EPO，G-CSF和IL-3協(xié)同作用支持多系克隆BFU-E，CFU-GM和CFU-GEMM等的生長(zhǎng)。SCF在體內(nèi)外擴(kuò)增干細(xì)胞、干細(xì)胞動(dòng)員、再生障礙貧血等方面有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。 本研究通過(guò)基因工程方法設(shè)計(jì)并構(gòu)建了攜帶SCF/TP

10、O融合基因的原核表達(dá)載體，收集并純化該融合蛋白。在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了該融合蛋白有較好的造血促進(jìn)作用。 首先，根據(jù)已發(fā)表的資料設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，以從胎肝細(xì)胞中提取總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增所需的SCF和TPO氨基端功能區(qū)片段。采用融合基因策略，將SCF和TPO基因融合并連接于原核表達(dá)載體PET32a的salI-NotI位點(diǎn)中，通過(guò)0.5MIPTG誘導(dǎo)引發(fā)下游的SCF-TPO融合基因的高表達(dá)。融合基因主要以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量

11、高達(dá)全菌蛋白的30％以上。分別采用抗SCF和抗TPO的多克隆抗體對(duì)上述表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Westernblot鑒定，發(fā)現(xiàn)在60KD處分別有明顯的陽(yáng)性條帶，表明我們已成功地獲得了SCF-TPO融合蛋白。 隨后，我們建立了高效快捷行之有效的分離大量重組SCF-PO融合蛋白的下游純化路線(xiàn)，即金屬螯合層析法。由于所選用的原核表達(dá)載體pET32a在表達(dá)目的蛋白N端帶有6個(gè)組氨酸，這將十分有利于通過(guò)Ni-NTA金屬螯合層析法快速高效地純化表達(dá)產(chǎn)物

12、。由此方法純化的SCF-PO融合蛋白的純度可達(dá)90％以上，而且總回收率高。 最后我們開(kāi)展了對(duì)SCF-PO融合蛋白體外生物學(xué)功能的研究。采用分析軟件，對(duì)我們?cè)O(shè)計(jì)的SCF-PO融合蛋白的柔性、抗原性、親水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)等分子生物學(xué)特性進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)。證明該融合蛋白保留了SCF和TPO原有氨基端的生物學(xué)特性，所設(shè)計(jì)的接頭具有高柔性、低抗原性和低表位性。選用對(duì)人GM-CSF依賴(lài)的MO-7e細(xì)胞株鑒定了純化復(fù)性后SCF-TPO融合蛋白

13、對(duì)MO-7e細(xì)胞株的促增殖作用。MTT法檢測(cè)的結(jié)果表明SCF-TPO融合蛋白能明顯刺激MO-7e細(xì)胞的增殖。該融合蛋白在一定培養(yǎng)條件下對(duì)小鼠骨髓CFU-MK集落細(xì)胞具有維持生長(zhǎng)作用，這種作用可以持續(xù)3周。 綜上所述，通過(guò)本研究我們成功地構(gòu)建了SCF-TPO融合基因的高效原核表達(dá)體系，通過(guò)純化得到了純度高達(dá)90％的目的蛋白，應(yīng)用兩步透析法獲得了復(fù)性良好的SCF-TPO融合蛋白，在體外實(shí)驗(yàn)中初步證實(shí)SCF-TPO融合蛋白同時(shí)具有SC