血小板去唾液酸化：膿毒癥血小板減少的一種新型發(fā)病機(jī)制和治療目標(biāo).pdf

1、目的：
　　本研究旨在明確血小板去唾液酸化與膿毒癥血小板減少發(fā)病的關(guān)系，從而詮釋膿毒癥血小板減少癥的一種可能的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)評(píng)價(jià)唾液酸酶抑制劑奧司他韋在嚴(yán)重膿毒癥血小板減少癥患者促進(jìn)或改善血小板生長(zhǎng)的重大作用，為膿毒癥血小板減少癥的治療提供新的治療目標(biāo)和對(duì)策。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象的選擇:采用前瞻性、隨機(jī)、多中心、臨床對(duì)照研究(RCT)方法，選擇201405月到2016-2月入住山東齊魯醫(yī)院、煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院、煙

2、臺(tái)傳染病醫(yī)院和煙臺(tái)山醫(yī)院的來(lái)自ICU、呼吸科、血液科、傳染病科的感染伴或者不伴有血小板減少的膿毒癥患者，包括嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克患者。
　　2.研究分組:研究Ⅰ選取健康成年人為陰性對(duì)照組;隨機(jī)選取入住年齡在18到80歲的膿毒癥患者，根據(jù)感染后伴或不伴血小板減少分為:(1)膿毒癥血小板減少組;(2)膿毒癥血小板正常組。研究Ⅱ選取嚴(yán)重膿毒癥伴血小板減少(PLT≤50×109/L)患者，根據(jù)電腦隨機(jī)序列號(hào)，隨機(jī)分為;(1)奇數(shù)號(hào):奧司

3、他韋應(yīng)用組;(2)偶數(shù)號(hào):對(duì)照組。
　　3.入選標(biāo)準(zhǔn):膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克患者診斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)2012年國(guó)際嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克診療指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)。簡(jiǎn)單說(shuō)，膿毒癥是由明確或疑似感染加上至少兩個(gè)下列條件:體溫高于38.3℃或低于36℃，心率超過(guò)90次/分，呼吸急促，精神狀態(tài)改變，白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)大于12×109/L或小于4×109/L或升高的血漿原降鈣素(PCT)的水平。嚴(yán)重膿毒癥定義為膿毒癥+器官功能障礙。膿毒性休克

4、被定義為膿毒癥+低血壓（液體復(fù)蘇難以糾正的低血壓）或高乳酸血癥。血小板減少癥診斷標(biāo)準(zhǔn):細(xì)菌、病毒、真菌等感染致病菌導(dǎo)致血小板減少，血小板計(jì)數(shù)小于100×109/L。
　　4.排除標(biāo)準(zhǔn):假性血小板減少（血標(biāo)本凝固，或者EDTA依賴的血小板抗體是否存在）;年齡小于18歲或者大于85歲;入院小于24小時(shí);心肺復(fù)蘇術(shù)后患者;懷孕和哺乳期患者;惡性腫瘤或血液病患者;有骨髓、肝、腎、小腸移植史患者;6個(gè)月內(nèi)接受或正在接受免疫抑制劑和激素治療患

5、者;終末期肝或腎功能衰竭者;測(cè)試前輸注血小板患者;藥物相關(guān)性血小板減少患者，如抗生素、肝素、低分子肝素、Ⅱ b/Ⅲa受體阻滯劑、ADP—受體拮抗劑、急性酒精中毒等。
　　5.研究終點(diǎn):主要觀察結(jié)果為血小板去唾液酸化水平、血小板整體反應(yīng)率和全因28天死亡率。次要結(jié)果包括血小板恢復(fù)時(shí)間、血小板輸注量。血小板整體反應(yīng)率被定義為入組后血小板計(jì)數(shù)恢復(fù)至正常水平以上(100×109/L)的人數(shù)占入組總?cè)藬?shù)百分比。血小板恢復(fù)時(shí)間計(jì)算為患者入組到

6、血小板計(jì)數(shù)＞100×109/L的時(shí)間間隔。
　　6.數(shù)據(jù)收集:入組患者記錄以下數(shù)據(jù):1）患者年齡、性別、疾病、既往病史、住院號(hào)、入住ICU原因。2）入住重癥患者24h序貫器官衰竭評(píng)分(SOFA)和急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)(APACHEⅡ)及預(yù)后死亡率、住ICU時(shí)間、住院時(shí)間、ICU死亡率及全因28天死亡率。3）血小板去唾液酸化水平。4）入組時(shí)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)包括血液和化學(xué)測(cè)試，凝血化驗(yàn)和動(dòng)脈血?dú)夥治觥?)明確感染致病菌的各種檢驗(yàn)

7、，如病毒相關(guān)抗體檢測(cè)、G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)，及各種臨床標(biāo)本的細(xì)菌培養(yǎng)，如痰、肺泡灌洗液、血、尿、引流液、分泌物等。6）干預(yù)治療，如機(jī)械通氣和持續(xù)腎臟替代治療(CRRT)。7)各種并發(fā)癥出現(xiàn)，如膿毒癥休克、急性呼吸衰竭綜合征、出血和血栓等事件。8）血小板輸注數(shù)量。各種實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)采集限定在膿毒癥發(fā)病的24小時(shí)內(nèi)。
　　7.奧司他韋的應(yīng)用:研究Ⅱ兩組患者治療上均根據(jù)2012拯救嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克的診治原則，予以抗感染、液體復(fù)蘇、血管活性

8、藥物等相關(guān)治療。奧司他韋治療組:應(yīng)用足量抗生素基礎(chǔ)上，入組24小時(shí)內(nèi)開始給予奧司他韋75mg q12h口服5天;對(duì)照組:只應(yīng)用足量抗生素，兩組患者均每日檢測(cè)血小板的計(jì)數(shù)，直到血小板升至100×109以上。不良反應(yīng)記錄:重點(diǎn)記錄發(fā)熱、皮疹、惡心、嘔吐、肝功能不良反應(yīng)及血栓形成等不良反應(yīng)。
　　8.血小板制備:抽取受試者外周靜脈血2ml放入真空抗凝（EDTA或者肝素抗凝）管中，離心得富含血小板血漿，取20-50ul加入流式管中離心，得

9、血小板沉淀。同時(shí)檢測(cè)血常規(guī)明確血小板計(jì)數(shù)。
　　9.去唾液酸化檢測(cè):流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板表面去唾液酸化后暴露的β Gals的水平，即以PE-Cy5-CD41a單克隆抗體標(biāo)記血小板，并同時(shí)標(biāo)以FITC-RCA-Ⅰ，F(xiàn)ITC-ECL，F(xiàn)ITC-sWGA，測(cè)定記錄RCA-Ⅰ、ECL、sWGA的熒光百分比用來(lái)反映血小板去唾液酸化水平。
　　結(jié)果：
　　1.整個(gè)研究中，276名患者被觀察，261例符合入組標(biāo)準(zhǔn)。其中134個(gè)是膿毒

10、癥不伴有血小板減少癥患者，127人為膿毒癥伴血小板減少癥患者。而127例膿毒癥不伴有血小板減少癥患者中，110名為嚴(yán)重膿毒癥患者同時(shí)血小板計(jì)數(shù)小于50×109/L參與研究Ⅱ。隨機(jī)化后僅52例患者使用抗生素治療（對(duì)照組），而其他54患者使用抗生素治療+奧司他韋（奧司他韋組）。28天隨訪完成率為96.4％。
　　2.膿毒癥血小板減少患者比沒(méi)有血小板減少癥的患者有較高的SOFA評(píng)分[10(5，12)和5(3.25，7)，P＜0.001)

11、、PCT水平[6.69(1.0，38.9)和1.0(0.32，5.36)，P＜0.001)和肌酐水平[88(63.3，225)μmol/L和225(56，119.0)μmol/L，P=0.036)，但有較低的平均動(dòng)脈壓(79.6±14.7 vs86.8±15.5mmHg，P＜0.001)。膿毒癥血小板減少癥患者比沒(méi)有血小板減少癥的有較高的腎臟替代(25.2％比14.2％，P=0.029)和膿毒性休克(18.9％比8.2％，P=0.017

12、)發(fā)生率。28天死亡率高膿毒癥血小板減少癥患者和無(wú)血小板減少癥的患者比(分別為36.2％和14.2％，P＜0.001)。
　　3.影響28天死亡率的危險(xiǎn)因素分析結(jié)果表明血小板計(jì)數(shù)與28天死亡率呈負(fù)相關(guān)(OR=0.963,95％ CI:0.930-0.997,P=0.033)
　　4.研究表明，血流感染、大腸桿菌和新布尼亞病毒感染是膿毒癥患者易發(fā)生血小板減少癥的危險(xiǎn)因素。相比之下，肺部感染和銅綠假單胞菌綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌

13、引起的膿毒癥，血小板減少癥的發(fā)生率相對(duì)少。
　　5.數(shù)據(jù)表明，膿毒癥伴血小板減少癥患者其血小板去唾液酸化水平較不伴有血小板減少癥患者明顯增高，正如檢測(cè)凝集素對(duì)比ECL(5.70±4.37％ vs2.33±1.90％;P＜0.001)，RCA-Ⅰ(95.64±4.19％ vs90.14±8.88％;P＜0.05)or sWGA(0.50±0.293％ vs0.15±0.95％;P＜0.001)。
　　6.奧司他韋治療治療后兩組

14、的反應(yīng)和結(jié)果提示，隨機(jī)化治療后15天內(nèi)血小板反應(yīng)率在奧司他韋組是45對(duì)54例(83.3％)相比，對(duì)照組是34對(duì)52例對(duì)照組(65.4％，P=0.045)。血小板恢復(fù)時(shí)間對(duì)比奧司他韋組5(4，6)天，對(duì)照組7(5，10)天(P＜0.01)。血小板輸血量奧司他韋組(0.676±1.36單位)較對(duì)照組(1.35±1.98單位; P=0.044)明顯減少。
　　7.奧司他韋治療后兩組血小板計(jì)數(shù)隨著時(shí)間變化對(duì)比。最初，血小板計(jì)數(shù)分別為奧司他

15、韋組41.81±10.29×109/L和對(duì)照組46.69±9.13×109/L，兩組之間無(wú)顯著差異(P=0.560)。兩組血小板計(jì)數(shù)隨著時(shí)間不斷增加，第四天奧司他韋組達(dá)到91.30±21.51×109/L、對(duì)照組達(dá)到58.17±32.99×109/L，P=0.031，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從第四天到九天，兩組之間有顯著差別，其中第7、8、9天差異十分顯著，第十天血小板計(jì)數(shù)分別為奧司他韋組198.8±82.6×109/L，對(duì)照組147.7±81.

16、78×109/L，P=0.684，自第十天后兩組血小板計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異。
　　8.多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型被用來(lái)評(píng)估各個(gè)變量與奧司他韋治療的影響，其中SOFA、血小板生長(zhǎng)有效時(shí)間、機(jī)械通氣、CVVH的P值均＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示以上因素均影響奧司他韋治療的成功率。
　　結(jié)論：
　　1.膿毒癥血小板減少患者血小板表面去唾液酸化水平明顯高于不伴有血小板減少患者，表明血小板去唾液酸化很可能參與了膿毒癥血小板減少的發(fā)病