發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒糖蛋白、核蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其生物學(xué)活性的研究.pdf

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)，是一種新發(fā)出血熱性傳染病，由一種新的布尼亞病毒，簡(jiǎn)稱SFTSV引起。SFTS每年的發(fā)病率大約是每10萬(wàn)農(nóng)村人口中有5人發(fā)病，主要感染中老年人，病死率平均是12％。自2009年在中國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，SFTSV已在韓國(guó)和日本報(bào)道，相似病毒在美國(guó)報(bào)道。SFTSV是布尼亞病毒科白蛉病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒，包含L、M、S三個(gè)片

2、段，分別編碼RNA聚合酶、糖蛋白(Gn、Gc)前體、核蛋白NP和非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。其中Gn、Gc最可能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，目前已有研究發(fā)現(xiàn)能結(jié)合M片段的單克隆抗體(MAb4-5)可以中和SFTSV;而S片段最為保守，NP最易表達(dá)，常被用來(lái)做免疫檢測(cè)用。本研究旨在構(gòu)建NP、Gn、Gc及M片段分段蛋白的真核表達(dá)載體，表達(dá)相應(yīng)蛋白，從抗原性和免疫原性方面檢測(cè)NP的生物學(xué)活性，為進(jìn)一步研究中和抗體做好鋪墊。
　　目的：
　　1、構(gòu)建

3、核蛋白NP，糖蛋白Gn、Gc真核表達(dá)載體。
　　2、構(gòu)建M片段（編碼糖蛋白）分段真核表達(dá)載體。
　　3、表達(dá)核蛋白，研究重組核蛋白NP的生物學(xué)活性。
　　方法：
　　1、設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增NP、Gn和Gc。
　　2、設(shè)計(jì)引物分20段擴(kuò)增M片段(M1-M20)，每段重疊30個(gè)堿基。
　　3、設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增NP、Gn和M1，建立與GFP的融合蛋白序列，監(jiān)測(cè)蛋白表達(dá)情況。
　　3、將目的基因與克隆載體19

4、T(Simple)連接擴(kuò)增后，再與表達(dá)載體pVAX1連接。
　　4、將目的基因-pVAX1構(gòu)建的表達(dá)載體用陽(yáng)性脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，在Vero細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，用Western blot、間接免疫熒光、顯微鏡觀察融合蛋白熒光的方法檢測(cè)蛋白表達(dá)，用鎳柱純化帶His標(biāo)簽的NP。
　　5、包被純化的NP，包被板與商品化試劑盒同時(shí)檢測(cè)羊血清中SFTSV抗體，比較檢測(cè)的效果。
　　6、用純化的NP免疫BALB/c小鼠，測(cè)定血清滴

5、度。
　　結(jié)果：
　　1、構(gòu)建出核蛋白NP，糖蛋白Gn、Gc，M片段分段蛋白的真核表達(dá)載體，構(gòu)建出NP、Gn、Gc、M1分別和GFP的融合蛋白表達(dá)載體，測(cè)序正確。檢測(cè)到上述蛋白在Vero細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2、用NP自行包被的包被板與商品化的試劑盒在檢測(cè)羊血清陽(yáng)性率的效果上，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、用NP免疫BALB/c小鼠獲得有效陽(yáng)性血清。
　　結(jié)論：
　　1、構(gòu)建的pVAX1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染V