中樞內(nèi)源性硫化氫參與大鼠膿毒性休克的機(jī)制研究.pdf

1、[背景]：膿毒癥是外科常見急危重癥。它是由于感染等因素所致的炎癥反應(yīng)綜合征，是嚴(yán)重?zé)齻?、休克、外科大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，膿毒癥發(fā)生的重要原因在于機(jī)體過度釋放細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)失控和免疫功能紊亂可發(fā)展成為膿毒性休克(即嚴(yán)重膿毒癥伴經(jīng)液體復(fù)蘇仍難以逆轉(zhuǎn)的低血壓)和多器官功能障礙綜合征(multiple organs dysfunction syndrom，MODS)。這些常常是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的重要原因。膿毒血癥的研究多集中

2、膿毒血癥不同時(shí)期各種炎癥因子如腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、白介素-1β(IL-1β)及高遷移率族蛋白-1(high mobility group box-1 protein，HMGB-1)等，產(chǎn)生和釋放導(dǎo)致的人體主要內(nèi)臟器官損傷的研究，近年來有關(guān)膿毒血癥過程中，內(nèi)源性小分子信號(hào)氣體的釋放對(duì)于膿毒癥休克下心血管系統(tǒng)病理生理改變的研究成為一大熱點(diǎn)。上世紀(jì)八九十年代，機(jī)體內(nèi)源生成的氣體NO、CO通過非受體依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制具有舒張血管、抑

3、制血小板聚集和抑制細(xì)胞增殖等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，開創(chuàng)了“氣體信號(hào)分子”這一新的研究領(lǐng)域。1989年Goodwin等在牛、鼠和人等哺乳動(dòng)物腦中發(fā)現(xiàn)較高濃度的內(nèi)源性H2S的存在(50-160 mmol/L)H2S作為一種神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和細(xì)胞信號(hào)傳遞信使，調(diào)節(jié)消化道和血管平滑肌張力，抑制血管平滑肌增殖生理及病理生理過程中也扮演重要角色，因此被普遍認(rèn)為是繼NO、CO后內(nèi)源性小分子氣體信號(hào)家族的重要成員。本研究在建立膿毒性休克及內(nèi)毒素休克大鼠模型的基

4、礎(chǔ)上，觀察大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中H2S含量及CBS活性的變化與低血壓、外周組織損傷的關(guān)系，從而探討中樞H2S是否在膿毒癥休克時(shí)發(fā)揮作用；并觀察中樞H2S在生理?xiàng)l件下對(duì)血壓及心率的影響，旨在探討中樞H2S在生理?xiàng)l件下在心血管系統(tǒng)中的作用及其機(jī)制，最后在膿毒性休克大鼠模型上，觀察中樞內(nèi)源性H2S對(duì)心血管系統(tǒng)的作用及機(jī)制，以期進(jìn)一步揭示膿毒癥休克的發(fā)病機(jī)制。 1.膿毒性休克及內(nèi)毒素休克大鼠腦中內(nèi)源性H2S含量測定 [目的]：測定內(nèi)

5、源性硫化氫(H2S)在膿毒性休克和內(nèi)毒素休克大鼠中樞神經(jīng)中的含量及CBS活性。觀察大鼠MBP、HR變化及測定血糖、血乳酸含量。 [方法]：清潔級(jí)雄性SD大鼠62只，體重在200-250g分為膿毒性假手術(shù)組-1(Sham group of septic shock，SGSS，n=13)，膿毒性休克組(Septic shock，SS，n=16)；內(nèi)毒素休克對(duì)照組(Control group of endotoxic shock，CG

6、ES，n=13)與內(nèi)毒素休克組(endotoxic shock，ES，n=16)。用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)制備膿毒性休克，尾靜脈注射內(nèi)毒素法(LPS)制備內(nèi)毒素休克大鼠模型，測定大鼠中樞內(nèi)源性H2S含量及CBS活性。右側(cè)股動(dòng)脈插管測定BP、HR變化并測定血漿中血糖及乳酸含量。 [結(jié)論]：以上結(jié)果說明中樞內(nèi)源性H2S可能參與休克過程中的心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)。而中樞內(nèi)源性硫化氫在生理?xiàng)l件下是否參與心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)尚未見相關(guān)報(bào)道，因此我

7、們進(jìn)行了以下研究。 2.內(nèi)源性硫化氫的中樞心血管效應(yīng)與KATP通道開放機(jī)制有關(guān) [目的]：觀察中樞內(nèi)源性H2S的心血管效應(yīng)及其機(jī)制。材料：清潔級(jí)雄性SD大鼠80只，體重在200-250g；硫氫化鈉(NaHS)、S-腺苷左旋蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)、格列苯脲(Glibenclamide，GEI)。NaHS及SAM分別溶解于人工腦脊液，GLI初始溶解于二甲基亞砜(Dimethyl su

8、lfoxide，DMSO)后以人工腦脊液(Artificial cerebrospinal fluid，aCSF)稀釋至最終濃度。 方法：雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為對(duì)照組-1(i.c.v.5μL aCSF，n=6)、NaHS低劑量組(i.c.v.0.2μM，n=6)、中劑量組(i.c.v.2μM，n=6)、高劑量組(i.c.v.2μM，n=6)；對(duì)照組-2(i.C.v.5μL aCSF，n=6)、S-腺苷-左旋蛋氨酸(SAM)

9、低劑量組(i.c.v.5μmol，n=6)、中劑量組(i.c.v.10μmol，n=5)和高劑量組(i.c.v.20μmol，n=7)，aCSF+NaHS組(n=8)、aCSF+SAM組(n=8)，KATP阻滯劑格列苯脲組GLI+NaHS(n=8)和GLI+SAM組(n=8)。腹腔注射氨基甲酸乙酯(Urethane)1.0g/㎏麻醉，氣管插管，右側(cè)股、動(dòng)靜脈插管，固定于立體定位儀，于大鼠側(cè)腦室(Lateral cerebral vent

10、ricle，LCV)進(jìn)行側(cè)腦室注射(Intracerebroventricular injection，i.c.v.)。主要觀察指標(biāo)：①側(cè)腦室注射不同劑量NaHS、SAM后對(duì)血壓及心率的影響。②KATP通道阻斷劑GLI i.c.v.預(yù)處理后分別i.c.v.NaHS及SAM后中樞心血管效應(yīng)的影響。 結(jié)論：(1.)中樞內(nèi)源性H2S可能通過KATP通道的開放降低BP、HR。(2.)i.c.v.SAM導(dǎo)致的中樞內(nèi)源性H2S引起的降低BP

11、、減慢HR的作用可能與KATP通道開放有關(guān)。 3.中樞H2S對(duì)膿毒性休克大鼠心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié) [目的]：探討中樞內(nèi)源性硫化氫(H2S)在膿毒性休克狀態(tài)下對(duì)心血管活動(dòng)的影響。 [方法]：中樞給予CBS抑制劑羥胺，KATP通道阻滯劑格列苯脲后，用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)制備膿毒血癥大鼠模型，18h后測定大鼠BP、HR、血漿中乳酸及血糖含量。 [結(jié)果]：中樞預(yù)先給予GLI的膿毒性休克組大鼠(Glibenclam

12、ide，GLI，n=16)與預(yù)先給予aCSF的膿毒性休克大鼠組(Septic shock，n=16)比較平均動(dòng)脈壓(MBP)及心率(HR)均升高(55±8vs.30±3mmHg，P<0.05)(278±26 vs.198±44bpm，P<0.05)；而中樞預(yù)先給予羥胺的膿毒性休克組大鼠(Hydroxylamine，HA，n=16)與膿毒性休克大鼠組(Septic shock，n=16)比較平均動(dòng)脈壓(MBP)及心率(HR)均亦升高(48

13、±6vs.30±3mmHg，P<0.05)(255±30 vs.198±44bpm，P<0.05)；與假手術(shù)組(sham，n=16)比較膿毒性休克大鼠組(Septic shock，n=16)平均動(dòng)脈壓(MBP)及心率(HR)均顯著降低(98±6 vs.30±3mmHg，P<0.01)(408±36vs.198±44 bpm，P<0.01)；中樞預(yù)先給予GLI的膿毒性休克組大鼠(Glibenclamide，GLI，n=16)平均動(dòng)脈壓(M

14、BP)及心率(HR)與假手術(shù)組(sham，n=16)比較亦降低(55±8vs.98±6 mmHg，P<0.01)(278±26vs.408±36 bpm，P<0.01)中樞預(yù)先給予HA的膿毒性休克組大鼠(Hydroxylamine，HA，n=16)與假手術(shù)組(sham，n=16)比較大鼠平均動(dòng)脈壓(MBP)及心率(HR)辦降低(48±6vs.98±6mmHg，P<0.01)(255±30vs.408±36bpm，P<0.01)與假手術(shù)組

15、(sham，n=16)比較膿毒性休克組(septic shock，n=16)、格列苯脲組(Glibenclamide，GLI，n=16)及羥胺組(Hydmxylamine，HA，n=16)血糖均下降(3.82±0.32vs.7.06±0.28，p<0.05)，(3.02±0.32vs.7.06±0.28，p<0.05)(3.59±0.47vs.7.06±0.28，p<0.05)。而與膿毒性休克組(Septic shock，n=16)比較

16、，格列苯脲組(Glibenclamide，GLI，n=16)及羥胺組(Hydroxylamine，HA，n=16)的血糖值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但大鼠血乳酸水平在膿毒性休克組、格列苯脲組及羥胺組與假手術(shù)組比較均升高(1.56±0.26 vs.7.16±0.6，P<0.05)，(1.56±0.26 vs.7.68±0.4，P<0.05)，(1.56±0.26 vs.6.38±0.6，P<0.05)。格列苯脲組及羥胺組與膿毒性休克組相比血乳酸水平