豬實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立及其脊髓磁共振彌散張量成像研究.pdf

1、研究背景:
　　多發(fā)性硬化(multiplesclerosis，MS)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervessystem,CNS)的炎性脫髓鞘疾病。臨床上以病變部位及發(fā)病次數(shù)的多發(fā)性為特點。病理上以中樞神經(jīng)系統(tǒng)中局灶性脫髓鞘和不同程度的炎性病變﹑軸突損傷和膠質(zhì)瘢痕的形成為特征。雖然多發(fā)性硬化的標(biāo)志性病理改變是脫髓鞘，然而最近的研究表明軸突的病理改變在疾病的早期階段業(yè)已存在。脊髓病變在多發(fā)性硬化患者中廣泛存在，而且研究

2、表明因軸突喪失而引起的脊髓萎縮與多發(fā)性硬化患者永久性神經(jīng)功能障礙密切相關(guān)。迄今為止，人們對于軸突損傷的病理機(jī)制知之甚少，且沒有任何一種有效的治療能夠阻止軸突的損傷。因而尋找一種新的有效手段用于研究軸突損傷的潛在病理機(jī)制并對治療的有效性進(jìn)行精確的監(jiān)測是迫切而必要的。
　　核磁共振（MagneticResonance,MR）技術(shù)廣泛用于多發(fā)性硬化的研究，然而傳統(tǒng)的MR技術(shù)并不具有病理特異性。近年來諸如彌散張量（diffusionten

3、sorimaging，DTI）、氫質(zhì)子磁共振波譜（1H-MRspectroscopy，1H-MRS）、磁化傳遞成像（MagnetizationTransferImaging，MTI）等等一些具有相對病理特異性的MR新技術(shù)被用于MS病理機(jī)制的研究。特別是DTI技術(shù)能有效檢測軸突損傷并與脫髓鞘病變相區(qū)別。為MS病理機(jī)制的研究開辟了新的途徑。
　　對人體而言，活撿和尸檢是研究MS病理機(jī)制的兩種有效途徑。然而由于只能獲得MS病程中的間斷性

4、數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)的可靠性和完整性難免受到一定的限制。因而建立有效的MS動物模型是必要的。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimentalallergicencephalomyelitis,EAE）是一種自身免疫性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，被認(rèn)為是MS的首選動物模型。人們對MS病理機(jī)制及治療的認(rèn)識部分來源于EAE模型。嚙齒類動物被廣泛應(yīng)用于EAE模型的建立。遺憾的是，由于嚙齒類動物較小的中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是脊髓體積，其EAE模型并不適合于核磁共振研究。

5、即使使用高場微型磁共振系統(tǒng)（high-fieldmagneticresonancemicroimagingscanner），許多新技術(shù)的應(yīng)用仍然受到一定限制。少量研究使用靈長類動物模型進(jìn)行MR研究，然而由于靈長類動物獲取困難且價格昂貴，因而難以進(jìn)行大規(guī)模研究。最近的研究表明，豬是一種較適合建立EAE模型的大型動物。
　　研究目的:
　　1.（1）建立可靠的適合MRI成像的豬EAE模型。
　　（2）對EAE模型脊髓病變的

6、病理機(jī)制進(jìn)行研究。
　　2.（1）評估3T臨床MRI系統(tǒng)用于豬脊髓軸位DTI成像和定量檢測的可行性。
　?。?）定量分析DTI參數(shù)﹑脊髓病理改變和EAE臨床分?jǐn)?shù)的相關(guān)性。
　?。?）評估DTI參數(shù)監(jiān)測EAE發(fā)病及疾病進(jìn)展的能力。
　　材料與方法:
　　1.應(yīng)用牛脊髓勻漿(spinalcordhomogenate,SCH)、福氏佐劑和結(jié)核桿菌免疫雌性45-50kg的商品豬，耳靜脈注射百日咳桿菌，誘發(fā)豬EAE動

7、物模型。
　　2.應(yīng)用組織病理染色和免疫組化技術(shù)研究EAE的病理機(jī)制，具體包括：蘇木素－伊紅(Hematoxylin-Eosinstaining,HE)染色顯示炎性浸潤，LFB(Luxolfastblue)染色顯示脫髓鞘病變，Glees銀染顯示軸突喪失，淀粉樣前體蛋白(Myloidprecursorprotein,APP)免疫組織化學(xué)染色顯示急性軸突損傷。
　　3.5頭正常雌性45-50kg的商品豬用于評估3T臨床MRI系統(tǒng)

8、進(jìn)行豬脊髓DTI成像和定量檢測的可行性。3T臨床MRI系統(tǒng)對豬脊髓進(jìn)行常規(guī)T1WI、T2WI及DTI成像，DTI掃描采用基于平行采集技術(shù)（IntegratedParallelacquisitiontechniques，iPAT）的平面回波（EchoPlaneImaging，EPI）脈沖序列。定量測量C2/C3平面脊髓軸位白質(zhì)四個不同感興趣區(qū)（前柱，左側(cè)柱，右側(cè)柱和后柱）的軸向彌散（Axialdiffusivity，AD)、徑向彌散（ra

9、dialdiffusivity，RD)、部分各向異性（fractionalanisotropy，F(xiàn)A)和表觀彌散系數(shù)（apparentdiffusioncoefficient，ADC)值。測量采用西門子公司的SyngoMRB13圖像分析軟件平臺。用Bland-Altman法對DTI各參數(shù)的可重復(fù)性進(jìn)行評估，統(tǒng)計軟件采用MedCalcV7.5。
　　4.8頭急性豬EAE模型(P1－P8)用于定量分析DTI參數(shù)﹑脊髓病理改變的相關(guān)性。

10、分別于不同病程階段（兩頭在進(jìn)展期，臨床分?jǐn)?shù)分別為1和3；兩頭在峰值期，臨床分?jǐn)?shù)均為5；兩頭在緩解期，臨床分?jǐn)?shù)分別為4和2；兩頭在完全緩解期，臨床分?jǐn)?shù)為0）行MR掃描。于MR掃描后立即處死取脊髓標(biāo)本分別進(jìn)行組織病理和免疫組化染色。對DTI和定量病理改變進(jìn)行相關(guān)性分析，統(tǒng)計軟件采用SPSS14。
　　5.2頭急性豬EAE模型(EB、EC)用于評估DTI參數(shù)監(jiān)測EAE發(fā)病及疾病進(jìn)展的能力。在EAE疾病的全程，每日評估動物的臨床分?jǐn)?shù)，分別

11、在不同的時間點行MRI掃描并定量測量DTI參數(shù)值。用Spearman秩相關(guān)對DTI和臨床分?jǐn)?shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，統(tǒng)計軟件采用SPSS14。
　　結(jié)果:
　　1.通過后腿皮內(nèi)多點注射牛脊髓勻漿、福氏佐劑和結(jié)核桿菌，耳靜脈注射百日咳疫苗的方法，成功建立了急性豬EAE模型。病程表現(xiàn)為急性單向完全緩解型。
　　2.急性豬EAE模型的脊髓病理改變以炎性細(xì)胞浸潤和急性軸突損傷為主。僅在疾病峰值期可見少量脫髓鞘改變。在緩解期可見少量軸突

12、喪失且在臨床癥狀完全緩解后少量軸突喪失持續(xù)存在。
　　3.采用基于iPAT技術(shù)的EPI脈沖序列，3T臨床MRI系統(tǒng)可以獲得較高質(zhì)量的豬脊髓DTI圖像。Bland-Altman法評估顯示脊髓DTI參數(shù)值具有較好的可重復(fù)性。AD,RD,FA,和ADC的正常值分別為1.81×10-3(±0.06)mm2/s,0.32×10-3(±0.02)mm2/s,0.72×10-3(±0.08)和0.95×10-3(±0.11)mm2/s。這些DT

13、I參數(shù)值與正常人脊髓的DTI參數(shù)值基本相符。
　　4.AD值隨急性軸突損傷的增加而下降，兩者呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.84,P<0.001)，F(xiàn)A與急性軸突損傷雖然也有負(fù)相關(guān)的趨勢但相關(guān)性不強(qiáng)(r=-0.31,P<0.05)。
　　5.AD與臨床分?jǐn)?shù)間表現(xiàn)出很強(qiáng)的相關(guān)性(兩只動物的相關(guān)系數(shù)分別為：r=-0.86,P<0.001；r=-0.92,p<0.001)。
　　結(jié)論:
　　1.牛脊髓勻漿能有效誘導(dǎo)急性單向完全

14、緩解型豬EAE模型。靜脈注射百日咳疫苗、高劑量結(jié)核桿菌、皮內(nèi)注射可能是促進(jìn)EAE發(fā)病的有利因素。
　　2.急性豬EAE的脊髓病理改變以炎性浸潤和急性軸突損傷為主。伴有少量的脫髓鞘病變。急性軸突損傷可能獨立于脫髓鞘病變而單獨存在。絕大多數(shù)急性軸突損傷是可逆的。急性軸突損傷可能是引起豬EAE臨床神經(jīng)功能障礙的主要因素。
　　3.采用基于iPAT技術(shù)的EPI脈沖序列，3T臨床MRI系統(tǒng)能獲得較好的豬脊髓DTI圖像且能進(jìn)行DTI參數(shù)