紫杉醇發(fā)揮抗癌效應的濃度依賴機制及其與Bub1的相關(guān)性研究.pdf

1、本研究分為二部分：第一部分:紫杉醇對卵巢癌細胞的作用及其濃度依賴機制探討
　　 目的: 探討不同濃度紫杉醇對卵巢癌細胞發(fā)揮抗癌效應的機制以及紫杉醇誘導G2/M期阻滯與紡錘體檢測點蛋白Bub1的相關(guān)性。
　　 方法: 以50、10、1、0.1、0.01uM紫杉醇作用于人卵巢癌細胞系A2780，以未加藥細胞作為對照組，采用流式細胞術(shù)檢測不同濃度，不同時間紫杉醇作用下A2780細胞的周期分布變化情況。以50uM、1uM、0.0

2、1uM紫杉醇A2780細胞，作用時間依次為12、24、24小時，未加藥細胞作為對照組，流式檢測G2/M期阻滯情況，RT-PCR檢測Bub1mRNA的表達差異；采用胸苷對A2780細胞進行同步化處理后，流式分析0.01uM紫杉醇對細胞周期的影響；Annexin V/PI雙染流式細胞術(shù)分析50uM紫杉醇對細胞壞死的影響。
　　 結(jié)果:
　　 (1)當紫杉醇濃度為10uM，1uM，0.1uM時，G2/M期細胞比例明顯高于50u

3、M（P＜0.001），0.01uM組（P＜0.001）。且1uM組阻滯可持續(xù)至72小時，50uM組36小時后即觀察不到G2/M期阻滯，5nM組與未處理組相比始終未檢測到G2/M期阻滯。
　　 (2)1uM處理組G2/M期細胞比例和Bub1mRNA的表達均明顯高于另外兩個濃度組和未處理細胞。
　　 (3)A2780細胞經(jīng)同步化處理后給予0.01uM紫杉醇，經(jīng)過一個細胞倍增時間未觀察到G0/G1期阻滯。
　　 (4)

4、50uM處理組壞死細胞的比例明顯高于1uM，0.01uM組,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。
　　 結(jié)論:不同濃度紫杉醇發(fā)揮抗癌效應的機制不同，紫杉醇誘導G2/M期阻滯與紡錘體檢測點Bub1的表達呈正相關(guān)。
　　 第二部分:紫杉醇發(fā)揮抗癌效應依賴于紡錘體檢測點蛋白Bub1
　　 目的: 探討紡錘體檢測點蛋白Bub1在紫杉醇誘導G2/M期阻滯和發(fā)揮抗癌效應中的作用。
　　 方法:
　　 (1)以

5、不同濃度紫杉醇分別作用于A2780和A2780/TS細胞，作用時間為24小時，采用流式細胞術(shù)分析細胞周期；通過MTT法檢測細胞增殖情況，以1uM紫杉醇分別作用于A2780和A2780/TS細胞，作用時間為24，36，48小時，通過流式檢測凋亡情況。
　　 (2)采用胸苷和紫杉醇分別將A2780和A2780/TS細胞阻滯在G1/S早期和G2/M期，A2780和A2780/TS作為配對細胞，采用western－blot比較兩株細胞分

6、別在對數(shù)生長期，G1/S期和G2/M期Bub1蛋白的表達差異。
　　 (3)構(gòu)建Bub1的 shRNA表達載體（Bub1-shRNA），采用RNA干擾技術(shù)封閉A2780細胞中Bub1的表達，運用RT－PCR和western－blot檢測Bub1的封閉情況。
　　 (4)Bub1-shRNA瞬時轉(zhuǎn)染A2780細胞，轉(zhuǎn)染后給予紫杉醇，運用PI單染、流式分析細胞周期和中、晚期凋亡情況；Annexin V單染、流式分析早期凋亡情

7、況；采用Hoechst 33342染色法檢測有絲分裂指數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)A2780與A2780/TS細胞均在0.1-10uM的濃度范圍內(nèi)有高比例的G2/M期細胞含量，某些濃度下紫杉醇對前者誘導G2/M期阻滯的作用要強于后者（P1uM=0.045，P10uM=0.036）。MTT法檢測和流式分析均證實A2780細胞對紫杉醇的敏感性明顯高于A2780/TS細胞，（P0.01uM、P0.1uM、P1uM＜0.00

8、1，P10uM=0.021；P24h、P36h、P48h＜0.001）。
　　 (2)A2780和A2780/TS細胞經(jīng)1uM紫杉醇處理后，G2/M期細胞的比例和Bub1的表達均明顯高于對照細胞。
　　 (3)在對數(shù)生長期，G1/S期和G2/M期，A2780細胞Bub1蛋白的表達均高于A2780/TS細胞。
　　 (4)RT－PCR，western－blot均顯示轉(zhuǎn)染Bub1-shRNA后，A2780細胞中Bub

9、1蛋白的表達明顯下調(diào)。
　　 (5)封閉A2780細胞Bub1的表達后，有絲分裂指數(shù)降低（p=0.022）；G2/M期細胞比例減少，G0-G1期和S期細胞比例升高（PG2/M=0.018，PG0-G1=0.041，PS=0.024）；紫杉醇誘導中、晚期凋亡的效應明顯減弱（p=0.027），紫杉醇誘導早期凋亡的效應并不受影響（p=0.236）；紫杉醇對A2780細胞的增殖抑制率明顯減弱（P0.1uM=0.037，P1uM=0.04