利用靶標(biāo)序列捕獲結(jié)合第二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行胃癌樣本中激酶基因結(jié)構(gòu)變異的發(fā)現(xiàn)研究.pdf

1、激酶在各種生命活動(dòng)中起著重要的作用。一些激酶的突變是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因之一，引起細(xì)胞增殖、凋亡等行為的異常。對(duì)于引起腫瘤發(fā)生有至關(guān)重要作用的激酶，可作為治療腫瘤的靶點(diǎn)，并且為人類腫瘤病人的早期診斷和個(gè)體化靶向治療提供可能。與G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）相似，激酶是目前藥物研發(fā)的一大類重要的靶點(diǎn)。識(shí)別激酶中的影響蛋白質(zhì)序列的基因突變，對(duì)于理解激酶對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制具有重要的價(jià)值，人類基因組計(jì)劃完成后的基因芯片技術(shù)和新一代基因組測(cè)序技

2、術(shù)的發(fā)展，使得發(fā)現(xiàn)更多的基因突變更加便利。
　　 本文利用SureSelect液相捕獲目標(biāo)基因結(jié)合第二代測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)激酶基因在胃癌組織中的新突變及短片段的Inde l。利用Agilent公司的eArray在線平臺(tái)，對(duì)1 250個(gè)基因的外顯子區(qū)域進(jìn)行捕捉探針(釣餌)設(shè)計(jì)，包括518 個(gè)激酶基因，638 個(gè)GPCR基因，49 個(gè)ABC基因，45 個(gè)選自Cosmic數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因。以3 例胃癌患者的手術(shù)胃癌組織、癌旁非癌組織以及其中2

3、 人的外周血樣本，提取基因組DNA，進(jìn)行SureSelect 液相捕獲，并在SOLiD3 第二代測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示設(shè)計(jì)合成的探針可有效地捕捉并富集基因組DNA的目標(biāo)靶片段，定量PCR顯示富集效率可達(dá)29倍。擁有高達(dá)81.33％的富集效率及相對(duì)較高的平均覆蓋度。有95％的目標(biāo)區(qū)域>1×覆蓋度，平均測(cè)序深度為260×。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，共發(fā)現(xiàn)315 個(gè)激酶基因的818 個(gè)單核苷酸變異（SNV）。其中59 個(gè)（7.2％）為公共數(shù)據(jù)庫(kù)尚未有

4、收錄的全新SNV。我們得到104 個(gè)激酶基因的312 個(gè)SNV是改變氨基酸影響蛋白質(zhì)的，其中225 個(gè)SNV是在所有的腫瘤組織中都有發(fā)現(xiàn)。最終有35 個(gè)新的非同義SNV被發(fā)現(xiàn)。同時(shí)我們選擇了5 個(gè)SNV（PRKACA（P127S）、 PRKACG（rs3730386）、RPS6KB2（T228N）、LTK（R727H）以及MAP3K6 （rs1138294））進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，并且再檢測(cè)這些突變?cè)?2 個(gè)胃癌細(xì)胞系和89 例胃癌

5、石蠟樣本中的存在情況。結(jié)果顯示在5（15.7％）例細(xì)胞系和16 （18.0％）例臨床胃癌石蠟樣本中檢測(cè)到新突變PRKACA（P127S），在15（46.9％）例細(xì)胞系和50（56.2％）例石蠟樣本中檢測(cè)到已知突變PRKACG（rs3730386）， 63（70.8％）例臨床胃癌石蠟樣本中存在已知突變MAP3K6（rs1138294）。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)71 個(gè)激酶基因發(fā)生26 個(gè)小的缺失和74 個(gè)小的插入。通過Sanger測(cè)序法驗(yàn)證了MA