使用飛行質(zhì)譜結(jié)合PCR技術(shù)及第二代測序技術(shù)檢測乳腺癌與病毒相關(guān)性的研究.pdf

1、背景:
　　乳腺癌是全球女性最常見的癌癥類型,每年全世界估計(jì)有138萬新發(fā)病例以及超過45萬人死亡[1]。眾所周知,乳腺癌是一種多因素的疾病,其中包括遺傳,激素和環(huán)境因素等。近年有研究報(bào)道5％至10%的乳腺癌病例是由遺傳基因突變引起的[2,3],然而大多數(shù)乳腺癌的病因仍然是未知的。某些病毒,細(xì)菌和寄生蟲引起的感染已被確認(rèn)為癌癥的主要原因,據(jù)統(tǒng)計(jì)人類癌癥的16%與這些微生物相關(guān)[4]。因此,接種疫苗將可能有效地預(yù)防這些癌癥。根據(jù)國際

2、癌癥研究機(jī)構(gòu)(InternationalAgencyforresearchonCancer,IARC)報(bào)告,愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-BarrVirus,EBV),乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV),丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus,HCV),卡波西肉瘤皰疹病毒(Kaposi’sSarcomaHerpesVirus,KSHV),人類免疫缺陷病毒類型1(HumanImmunodeficiencyV

3、irusType1,HIV),人乳頭狀瘤病毒(HumanPapillomaVirus,HPV),人類T細(xì)胞淋巴性病毒類型1(HumanT-cellLymphotrophicVirusType-1,HTLV),幽門螺旋桿菌,華支睪吸蟲,泰國肝吸蟲,埃及血吸蟲都是人類致癌微生物[5]。例如,感染慢性乙型或丙型肝炎病毒會導(dǎo)致肝細(xì)胞癌。慢性丙型肝炎病毒感染也可引起非霍奇金淋巴瘤,尤其是B-細(xì)胞淋巴瘤。這些發(fā)現(xiàn)為預(yù)防和治療癌癥提供了一個重要研究思

4、路。
　　自從Bittner發(fā)現(xiàn)小鼠乳腺腫瘤病毒(MouseMammaryTumorVirus,MMTV)可引起小鼠乳腺腫瘤以來,哪些病毒與乳腺癌有關(guān),困擾了研究者幾十年。許多研究表明,HPV,EBV,MMTV,猿猴病毒40(SV40),KSHV可能和乳腺癌有一定聯(lián)系[7]。
　　在乳腺癌的研究中,HPV感染的致病作用仍存在爭議。有研究報(bào)道,大約有20%的人乳腺癌組織中HPV高危亞型呈陽性,尤其是HPV16,18和33[6]

5、。相反,其它研究在乳腺癌組織中沒有檢測到任何HPV亞型[7]。究其原因,我們認(rèn)為多可能與不同研究階段的技術(shù)手段和水平相關(guān)。
　　目的:
　　本研究擬通過近年新興和快速發(fā)展的飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF)結(jié)合多重PCR檢測的質(zhì)譜法(PCR-MS)及第二代基因測序技術(shù)(NGS)來檢測乳腺癌樣本中是否有病毒存在,從而發(fā)現(xiàn)乳腺癌可能的發(fā)病機(jī)制。
　　方法和結(jié)果:
　　PCR-MS在微生物檢測和確認(rèn)中是一個功能強(qiáng)大的工具,

6、它可以同時(shí)檢測多種感染。最近,課題組發(fā)明了一個新的高精確度的HPV基因分型檢測方法(MS-HPV),即使用PCR-MS檢測致癌的30種HPV亞型(E6和L1),這種方法可以避免質(zhì)譜檢測中常見的假陰性問題,使目標(biāo)只有一個(E6或L1)。PCR-MS方法防止PCR遺留污染和多探針之間的交互污染[8]。
　　在本實(shí)驗(yàn)中,首先使用PCR-MS方法對135例石蠟固定宮頸癌樣本進(jìn)行檢測,同樣也使用常規(guī)PCR+測序技術(shù)和商業(yè)HPV檢測試劑盒對所

7、有樣本進(jìn)行檢測,然后與結(jié)果進(jìn)行比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)新方法檢測單一HPV感染比商業(yè)化試劑盒方法靈敏度高(97%;90.4%),在多重感染的檢出中,新方法和商業(yè)化試劑盒方法的檢出率分別為(55.6%;25.2%)。通過PCR復(fù)檢,新方法的陽性率達(dá)87%(65/75)。
　　使用MS-PCR方法在乳腺癌,乳腺良性腫瘤及健康志愿者樣本中檢測HPV,SV40,BKPyV,JCPyV,WUPyV,KIPyV,MCPyV,EBV和KSHV病毒的檢出率

8、。陽性結(jié)果都通過PCR和DNA測序證實(shí)。結(jié)果為:在乳腺癌中EBV,MCPyV以及HPV檢出率分別為:74.0%,14%和2%;在乳腺良性病變中EBV和MCPyV檢出率分別為:32%和2%。結(jié)果表明EBV和MCPyV在乳腺癌中的感染率較乳腺良性病變有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(EBV:74.0%vs.32.0%,p<0.0001;MCPyV:14.0%vs.2.0%,p=0.02)。然而在外周血中這兩種病毒并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)EBV和MCP

9、yV在乳腺癌中的檢出率明顯高于乳腺良性疾病,但這兩種病毒是否為乳腺癌的高危誘因還需進(jìn)一步研究。
　　使用NGS聯(lián)合高性能生物信息算法,檢測8例乳腺癌樣本中的病毒。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)乳腺癌標(biāo)本中都檢出HPV16,部分標(biāo)本有HBV感染。結(jié)果為:HPV在外周血,轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),癌組織和癌旁組織中的檢出率分別為:5/8,7/8,7/8,7/8。HBV在外周血,轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),癌組織和癌旁組織中的檢出率分別為:7/8,8/8,7/8,8/8。四個組織中