氟尿嘧啶類藥物抑制胸苷磷酸化酶(TP)表達(dá)的胃癌細(xì)胞增殖機(jī)制的研究.pdf

1、目的
　　 胃癌是世界范圍內(nèi)最常發(fā)生的惡性腫瘤之一,在我國(guó)是腫瘤死亡的主要原因。大多數(shù)患者在診斷時(shí)已是進(jìn)展期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,化療是治療晚期胃癌的主要手段。
　　 氟尿嘧啶是胃癌化療的基本用藥,其藥理作用為通過DNA和RNA兩種途徑,干擾胸腺嘧啶的合成。其中,DNA途徑是氟尿嘧啶在胸苷磷酸化酶的催化下直接合成活性代謝產(chǎn)物胸腺嘧啶脫氧核苷(FdUMP),進(jìn)而影響細(xì)胞DNA的合成。
　　 卡培他濱、去氧氟尿苷等氟尿嘧啶

2、前體藥物在體內(nèi)也需經(jīng)胸苷磷酸化酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)榉蜞奏?進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
　　 本實(shí)驗(yàn)以胃癌細(xì)胞株SGC7901、MGC803為模型,對(duì)氟尿嘧啶類藥物的抗瘤活性及與胸苷磷酸化酶表達(dá)水平的關(guān)系進(jìn)行了研究。
　　 方法
　　 1、MTT法檢測(cè)去氧氟尿苷對(duì)兩種胃癌細(xì)胞的增殖抑制
　　 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人胃癌MGC803細(xì)胞,SGC7901細(xì)胞,進(jìn)行胰蛋白酶消化,消化后用培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10

3、4個(gè)/ml接種于96孔板,培養(yǎng)12小時(shí)后分別加入既定濃度的去氧氟尿苷,每孔最終體積200μl,加藥分別培養(yǎng)24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí)后,加入MTT,于相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h。加入DMSO,在恒溫振蕩器上振蕩10min,室溫20min孵育。放入酶標(biāo)儀中以570nm波長(zhǎng)檢測(cè)光密度值(optical density,OD)?？瞻渍{(diào)零組A490的OD值均數(shù)設(shè)為零,以平行孔的平均OD值作為各組的OD值。
　　 2、Western B

4、lot檢測(cè)兩種胃癌細(xì)胞胸苷磷酸化酶表達(dá)水平
　　 收集人胃癌MGC803細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞進(jìn)行Western Blot檢測(cè),加入抗PD-ECGF抗體孵育1h,TTBS洗膜,二抗孵育,洗膜,加入ECL發(fā)光液,孵育5min,曝光,顯影,定影。
　　 3、MTT法分別檢測(cè)去氧氟尿苷和氟尿嘧啶對(duì)SGC7901細(xì)胞的增殖抑制
　　 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SGC7901細(xì)胞,進(jìn)行胰蛋白酶消化,消化后用培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整

5、細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/ml接種于96孔板,培養(yǎng)12小時(shí)后分別加入既定濃度的去氧氟尿苷和氟尿嘧啶,每孔最終體積200gl,加藥分別培養(yǎng)48小時(shí),72小時(shí)后,加入MTT,于相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h。加入DMSO,在恒溫振蕩器上振蕩10min,室溫20min孵育。放入酶標(biāo)儀中以570nm波長(zhǎng)檢測(cè)光密度值(optical density,OD)?？瞻渍{(diào)零組A490的OD值均數(shù)設(shè)為零,以平行孔的平均OD值作為各組的OD值。
　　 4、

6、細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SGC7901細(xì)胞,進(jìn)行胰蛋白酶消化,消化后用培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105個(gè)/ml接種于6孔板,培養(yǎng)12小時(shí)后分別加入既定濃度的去氧氟尿苷和氟尿嘧啶。24小時(shí),48小時(shí)候分別收集對(duì)照組及處理組細(xì)胞,冷PBS洗2次,加入5ulAnnexinV和10ulPI避光孵育15min,用FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),判定凋亡百分率。CELLQuest軟件進(jìn)行分析。
　　 5、W

7、estern Blot檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞胸苷磷酸化酶的表達(dá)
　　 分別收集對(duì)照組及處理組細(xì)胞進(jìn)行裂解,提取細(xì)胞蛋白,取20μg處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶封閉1h,一抗孵育1h,TBST洗膜,然后二抗孵育30min,TBST洗膜后加入ECL發(fā)光液,孵育5min,暗室中用X片曝光,顯影,定影。
　　 結(jié)果
　　 1、高表達(dá)胸苷磷酸化酶的細(xì)胞系篩選
　　 通過進(jìn)行M

8、TT檢測(cè),發(fā)現(xiàn)去氧氟尿苷作用于SGC7901細(xì)胞與MGC803細(xì)胞后,SGC7901細(xì)胞的增殖抑制明顯強(qiáng)于MGC803細(xì)胞。通過Western Blot檢測(cè),在SGC7901細(xì)胞中,胸苷磷酸化酶表達(dá)水平明顯較MGC803細(xì)胞高
　　 2、氟尿嘧啶與去氧氟尿苷對(duì)SGC7901細(xì)胞的增殖抑制
　　 通過進(jìn)行MTT檢測(cè),發(fā)現(xiàn)無論是氟尿嘧啶還是去氧氟尿苷,對(duì)SGC7901細(xì)胞的增殖抑制都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、濃度的加大而逐漸增強(qiáng)。

9、r>　　 3、氟尿嘧啶與去氧氟尿苷對(duì)SGC7901細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)
　　 流式細(xì)胞儀分析顯示,氟尿嘧啶和去氧氟尿苷能誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡,且呈時(shí)間劑量依賴性。
　　 4、氟尿嘧啶與去氧氟尿苷對(duì)SGC7901細(xì)胞胸苷磷酸化酶表達(dá)水平的影響
　　 通過Western Blot檢測(cè),在藥物處理過的SGC7901細(xì)胞中,胸苷磷酸化酶的含量較對(duì)照組細(xì)胞明顯上調(diào),而且呈時(shí)間劑量依賴性。
　　 結(jié)論