慢病毒載體基因轉(zhuǎn)染建立胸苷磷酸化酶高表達(dá)人結(jié)腸癌細(xì)胞株.pdf

1、研究背景:
　　胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)是一種核苷代謝酶,其生理學(xué)作用主要體現(xiàn)在:在體內(nèi)特異性的催化胸苷去磷酸化,生成胸腺嘧啶和2-脫氧核糖-1-磷酸,為核酸補(bǔ)救合成途徑提供原料;在體外刺激內(nèi)皮細(xì)胞趨化和生長,在體內(nèi)促進(jìn)血管新生;此外抑制由于生理應(yīng)激、免疫監(jiān)視和抗腫瘤治療等引起的細(xì)胞凋亡。TP在許多實(shí)體瘤活性較高,而在腫瘤組織中,TP的活性又明顯高于相鄰的正常組織,因此TP對于評價(jià)和改善

2、腫瘤預(yù)后,指導(dǎo)化療用藥提供數(shù)據(jù)參考。TP是5'-脫氧氟尿苷(5'-deoxy-5-fluorouridine,5ˊ-DFUR)等5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)前體藥物轉(zhuǎn)化為5-FU的關(guān)鍵限速酶。由于腫瘤組織中TP的表達(dá)水平高于周圍正常的組織,所以臨床上5-FU的前體藥物進(jìn)入患者體內(nèi)后在腫瘤組織中更容易轉(zhuǎn)化為5-FU,這種治療就具有較高的靶向性。這便有效地克服了5-FU常對黏膜上皮細(xì)胞等正常組織細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒性反

3、應(yīng)的毒副作用。
　　慢病毒載體(Lentiviral vector,LVs)是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng),它既可感染分裂細(xì)胞,也可感染非分裂細(xì)胞,如神經(jīng)細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞等,還具有整合到宿主細(xì)胞基因組、穩(wěn)定長效轉(zhuǎn)染、感染效率高等優(yōu)點(diǎn),能高效將目的基因(或RNAi)導(dǎo)入動(dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。這些特點(diǎn)有效的克服了脂質(zhì)體等傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)染效率低,很難穩(wěn)定傳代的缺點(diǎn)。因此,近年來越來越多的學(xué)者開始使用慢病毒轉(zhuǎn)

4、染目的基因,以獲得TP高表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株。
　　目的:
　　以慢病毒為載體轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染胸苷磷酸化酶(TP)cDNA給人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480和LOVO,建立表達(dá)高度活性TP的穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　方法:
　　構(gòu)建包含TPcDNA全長的真核表達(dá)載體,用慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和LOVO,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率,實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測TPmRNA的表達(dá),蛋白印跡法(Weste

5、rn Blot)檢測TP蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　轉(zhuǎn)染TPcDNA后的SW480-TP與LOVO-TP監(jiān)測5代,感染效率穩(wěn)定在95％左右。兩株轉(zhuǎn)染細(xì)胞的TPmRNA表達(dá)分別比野生型細(xì)胞增加了694.56倍(P<0.01)和282.46倍(P<0.05),TP蛋白表達(dá)也明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論:慢病毒載體能夠高效地將TPcDNA轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和LOVO并穩(wěn)定傳代,轉(zhuǎn)染后兩株細(xì)胞的TPmRNA和TP蛋白表達(dá)明