表達(dá)β淀粉樣蛋白3-10及白細(xì)胞介素4融合蛋白的DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究.pdf

1、前言：
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是一種慢性的神經(jīng)系統(tǒng)變性病,是老年人進(jìn)行性記憶障礙和認(rèn)知功能障礙的最常見的原因。目前,AD的原因不清楚,也沒有滿意的治療方法。AD的神經(jīng)病理表現(xiàn)在大體病理呈彌漫性腦萎縮,鏡下病理包括老年斑(SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)和腦內(nèi)的神經(jīng)元缺失。老年斑的主要成分是β淀粉樣蛋白(Aβ),Aβ肽由淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過β和γ分泌酶酶解產(chǎn)生。AD病因?qū)W的著名假說

2、是淀粉樣蛋白瀑布假說,該學(xué)說認(rèn)為Aβ的異常聚集在AD的起病及進(jìn)展中起到核心作用。清除聚集的Aβ和/或阻止Aβ的形成和聚集可能成為有效的抗AD的治療策略。
　　 免疫治療可能是最有希望阻止和清除Aβ聚集的方法之一。研究表明,用Aβ42肽免疫AD模型鼠時(shí)能夠產(chǎn)生高滴度的抗Aβ抗體,減少鼠腦內(nèi)Aβ的沉積,并能使鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能得到改善。Aβ疫苗(AN1792)在Ⅱ期臨床試驗(yàn)時(shí),因?yàn)?%的病人出現(xiàn)了無菌性腦膜腦炎而被迫停止。隨后的研究

3、認(rèn)為無菌性腦膜腦炎由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)(Th1型免疫反應(yīng))引起,與抗體無關(guān)。而且Th1型免疫佐劑組合的選擇,包括皂角素(QS-21)和聚山梨醇酯80,加劇了Th1型免疫反應(yīng)。盡管這些病人沒有接受全程的主動(dòng)免疫,仍然有60%病人產(chǎn)生抗Aβ抗體,產(chǎn)生高滴度(20%)抗體的病人的認(rèn)知功能減退的速度明顯下降。對(duì)免疫病人的隨訪研究發(fā)現(xiàn)Aβ42免疫能清除病人腦內(nèi)的Aβ沉積。
　　 被動(dòng)免疫研究用抗Aβ抗體免疫APP轉(zhuǎn)基因鼠能減少鼠的老

4、年斑沉積并改善行為學(xué)。目前正在進(jìn)行著多個(gè)人源性單克隆抗Aβ抗體的臨床試驗(yàn)。但是被動(dòng)免疫也有其缺陷,如需反復(fù)注射,成本昂貴,需要足夠的血腦屏障滲透能力及出血的危險(xiǎn)等。所以仍然需要尋找安全有效的AD免疫治療策略。研究認(rèn)為主要誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)的免疫方式對(duì)于AD的預(yù)防和治療是安全的。為了建立一種能產(chǎn)生Th2型免疫反應(yīng)的安全AD免疫,研究者進(jìn)行了一些實(shí)驗(yàn)性免疫策略的探索,包括選擇Aβ的B細(xì)胞表位比如Aβ1-15,免疫佐劑修飾,改變免疫途徑及疫

5、苗運(yùn)送機(jī)制等。同時(shí)一些研究表明編碼Aβ的DNA疫苗免疫小鼠可以產(chǎn)生特異性的抗Aβ抗體,產(chǎn)生B細(xì)胞免疫反應(yīng),卻不發(fā)生有害的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
　　 在本研究中,我們構(gòu)建了DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4,編碼重復(fù)10次的Aβ3-10并且融入小鼠白細(xì)胞介素4(IL-4)作為基因佐劑。我們選擇Aβ3-10是因?yàn)锳β1-15已經(jīng)被確認(rèn)是B細(xì)胞表位。為了克服Aβ3-10肽段小免疫原性弱,我們編碼了重復(fù)10次的Aβ3-10片

6、段作為目的基因。而且選擇Th2型細(xì)胞因子IL-4作為佐劑加到(Aβ3-10)10以進(jìn)一步增強(qiáng)其免疫原性。在本研究中,我們構(gòu)建了DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mlL-4,并進(jìn)一步探討其作為AD疫苗的安全性及免疫效果。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 人工合成重復(fù)10次的Aβ-10片段(Aβ3-10)10,克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-mIL-4中,酶切位點(diǎn)為HindⅢ和EcoRⅠ。重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu):HindⅢkozak

7、sequence-(Aβ3-10)10-GGGGSlinker-BamHI-IL4一EcoRI。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α擴(kuò)增并大量提取。重組質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序鑒定。脂質(zhì)體方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。用Westernblotting方法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。將重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-mIL-4用電穿孔的方法肌肉注射免疫BALB/c小鼠,Aβ42肽及pcDNA3.1(+)作為對(duì)照。ELISA的方法測(cè)定免疫后血清中的抗體滴度、抗體

8、分型及體外脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子。免疫組化的方法檢測(cè)抗血清對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦Aβ斑的識(shí)別。用p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠,ELISA的方法測(cè)定免疫后血清中的抗體滴度、抗體分型、體外脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子及鼠血清和腦組織中的Aβ含量。水迷宮的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。免疫組化的方法檢測(cè)鼠腦內(nèi)的老年斑、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　

9、一、質(zhì)粒成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞
　　 重組質(zhì)粒成功構(gòu)建,經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定序列正確。成功轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,表達(dá)融合蛋白。
　　 二、重組質(zhì)粒免疫BALB/e小鼠的免疫效果
　　 1、血清抗體及分型測(cè)定重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-mIL-4組及Aβ42組免疫BALB/c小鼠后均產(chǎn)生了較高滴度的血清抗體,Aβ42組抗體滴度高于p(Aβ-10)10-mIL-4組,而pcDNA3.1(+)質(zhì)粒組未產(chǎn)生抗Aβ

10、抗體。P(Aβ3-10)10-mIL-4免疫BALB/c小鼠后產(chǎn)生的抗體以IgG1為主,p(Aβ3-10)10-mIL-4組IgG1/IgG2a比值約是Aβ42組的8倍。
　　 2、重組質(zhì)粒免疫后BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清的細(xì)胞因子檢測(cè)經(jīng)相應(yīng)抗原刺激后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中,Aβ42組及p(Aβ3-10)10-mIL-4組的IL-4的含量均明顯高于pcDNA3.1(+)組。Aβ42組的IFN-γ的含量最高,明顯高于P(Aβ3-10

11、)10-mIL-4組及pcDNA3.1(+)組。
　　 3、抗血清與APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的老年斑相結(jié)合經(jīng)免疫組織化學(xué)染色證實(shí)重組質(zhì)粒p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫BALB/c小鼠后產(chǎn)生的抗血清能與10月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的老年斑相結(jié)合。
　　 三、重組質(zhì)粒免疫APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的免疫效果
　　 1、血清抗體及分型測(cè)定ELISA結(jié)果:重組質(zhì)粒P(Aβ-10)10-mIL-4組及Aβ42

12、組免疫APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠后均產(chǎn)生了較高滴度的抗Aβ抗體,Aβ42組抗體滴度高于p(Aβ3-10)10-mIL-4組,而pcDNA3.1(+)質(zhì)粒組未產(chǎn)生抗Aβ抗體。P(Aβ3-1o)10-mIL-4組免疫后產(chǎn)生的抗體以IgG1為主,IgG1/IgG2c比值約是Aβ42組的8倍。
　　 2、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清的細(xì)胞因子檢測(cè)
　　 ELISA結(jié)果:經(jīng)相應(yīng)抗原刺激后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中,Aβ42組及p(Aβ3-10)10-mIL-

13、4組的IL-4的含量均明顯高于pcDNA3.1(+)組。Aβ42組的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量最高,明顯高于p(Aβ3-10)10-mIL-4組及pcDNA3.1(+)組。而P(Aβ3-10)10-mIL-4組和pcDNA3.1(+)組的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量沒有差別。
　　 3、免疫接種對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)記憶能力影響
　　 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):隱藏平臺(tái)定位航行實(shí)驗(yàn)中,p(Aβ3-10)1

14、0-mIL-4組、Aβ42組及pcDNA3.1(+)組小鼠搜索平臺(tái)的潛伏期呈逐漸下降趨勢(shì)。P(Aβ3-10)10-mIL-4組及Aβ42組小鼠的逃避潛伏期明顯低于pcDNA3.1(+)組。在探索實(shí)驗(yàn)中,1min內(nèi)p(Aβ3-10)10-mIL-4組及Aβ42組小鼠經(jīng)過平臺(tái)位置的次數(shù)明顯高于pcDNA3.1(+)組。表明p(Aβ3-10)10-mIL-4組及Aβ42組小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力得到改善。
　　 4、腦組織及血清中可溶

15、性Aβ42檢測(cè)
　　 ELISA結(jié)果顯示:無論是在腦組織中還是血清中,p(Aβ3-10)10-mIL-4組及Aβ42組的可溶性Aβ42水平均明顯高于pcDNA3.1(+)組,但兩組之間無差異。
　　 5、免疫后APP/PS1鼠腦內(nèi)的老年斑、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及微出血的免疫組化結(jié)果
　　 用免疫組化及定量分析方法。Aβ42組及p(Aβ3-10)10-mIL-4組,海馬及皮層Aβ斑與pcDNA3.

16、1(+)組相比明顯減少。與老年斑結(jié)果一致,Aβ42組及p(Aβ3-10)10-mIL-4組海馬及皮層的GFAP陽性細(xì)胞及Iba1陽性細(xì)胞與pcDNA3.1(+)組相比明顯減少。P(Aβ3-10)10-mIL-4組與pcDNA3.1(+)組腦內(nèi)無明顯CD3或CD4陽性表達(dá)細(xì)胞。而Aβ42組腦組織中可見大量CD3和CD4陽性的細(xì)胞。說明p(Aβ3-10)10-mIL-4與pcDNA3.1(+)免疫小鼠腦內(nèi)無明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),而Aβ42免疫小

17、鼠腦內(nèi)存在大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。HE染色中,3組轉(zhuǎn)基因鼠腦組織均未見微出血。
　　 結(jié)論：
　　 1、表達(dá)(Aβ3-10)10及mIL-4融合蛋白DNA疫苗p(Aβ-10)10-mIL-4成功構(gòu)建。
　　 2、DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫BALB/c小鼠后能夠產(chǎn)生高滴度的抗Aβ抗體,而且產(chǎn)生了Th2型免疫反應(yīng)。
　　 3、DNA疫苗p(Aβ1-10)10-mIL-4免疫APP/PS1轉(zhuǎn)基因