大蒜蒜酶中試生產(chǎn)工藝、酶學性質(zhì)及質(zhì)量標準研究.pdf

1、大蒜(Allium sativum L.)為百合科蔥屬多年生草本植物，作為藥食兩用歷史悠久?，F(xiàn)代醫(yī)學證明，大蒜主要具有抗感染、防治心腦血管疾病及抗腫瘤等三大功效。目前公認大蒜的功效成分是蒜酶(Alliinase，EC 4.4.1.4)催化裂解蒜氨酸(Alliin)產(chǎn)生的大蒜辣素(Allicin)、阿霍烯(Ajoene)等系列含硫有機化合物。由于大蒜有效成分的分離、提取或人工合成十分困難，蒜氨酸及大蒜辣素等單體的價格十分昂貴，而且大蒜辣素

2、化學性質(zhì)極不穩(wěn)定，易分解，無法長期保存，目前的技術(shù)不可能直接制成藥物制劑應用于臨床，因此，本項目組陳堅教授在國內(nèi)率先提出：從鮮蒜中分別提取化學性質(zhì)相對穩(wěn)定的蒜氨酸及蒜酶，然后科學組方，制成蒜氨酸/蒜酶復合制劑，讓其在體內(nèi)釋放大蒜辣素、阿霍烯等有效成分，充分發(fā)揮療效。 本論文在前期研究工作的基礎上，利用新疆優(yōu)勢大蒜資源主要完成以下研究內(nèi)容： 第一大蒜蒜酶提取純化的實驗室工藝研究。首先，建立了適用于提取中間體酶活力的測定方法

3、。即采用丙酮酸法測定酶活力，考馬斯亮蘭G-250法測定蛋白質(zhì)濃度，以此來計算比活力。然后，在大蒜蒜酶提取純化的實驗室工藝研究中依次完成：①確定粗酶浸提液的最佳組成為Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液(pH6.5)中含10％(V/V)甘油、20μmol/L PLP、1mmol/L CaC12；②分別優(yōu)選35％飽和度硫酸銨、15％(m/v)PEG8000沉淀酶蛋白；③引進超濾技術(shù)進一步純化、濃縮酶蛋白；④確認蒜酶最佳調(diào)節(jié)等電點為4.9。在

4、此基礎上，分別采用硫酸銨沉淀法和PEG8000沉淀法提取純化蒜酶各三批。利用實驗室小試制得的蒜酶樣品建立了HPLC法測定終產(chǎn)物蒜酶活力；采用SDS-PAGE法測定蒜酶分子量為108.0kDa。通過對大蒜蒜酶提取純化的實驗室工藝研究驗證了實驗目的的正確性、可行性，為大蒜蒜酶的中試生產(chǎn)研究積累數(shù)據(jù)、提供方法和經(jīng)驗。 第二大蒜蒜酶中試生產(chǎn)工藝研究。利用中試生產(chǎn)設備和條件，進行工藝放大研究：①確定蒜瓣浸提打漿以料液比分別為1:1和1:0

5、.5浸提兩次；②隨著浸提粗酶液濃度的改變，優(yōu)選硫酸銨沉淀酶蛋白的飽和度為45％；③選用Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液(pH6.5)作為蛋白沉淀的重溶液。通過對大蒜蒜酶中試生產(chǎn)工藝條件的進一步優(yōu)化，以大蒜蒜酶提取純化的實驗室工藝為基礎，制定蒜酶中試生產(chǎn)工藝流程和標準操作規(guī)程，并采用硫酸銨沉淀法提取純化大蒜蒜酶三批次，跟蹤監(jiān)測中試生產(chǎn)全過程，最終蒜酶中試產(chǎn)品的活力和收率均達到并超過了設計要求。SDS-PAGE法測定結(jié)果顯示，蒜酶分子量

6、為107.8kDa，與實驗室工藝研究結(jié)果極為接近，首次實現(xiàn)了大蒜蒜酶由實驗室小規(guī)模提取純化向機械化、自動化程度較高的中試及大規(guī)模生產(chǎn)的過渡與轉(zhuǎn)化。此外，利用中試生產(chǎn)的車間、設備和條件，采用PEG8000沉淀法制備粗酶，為后續(xù)研制大蒜蒜酶對照品提供純度和活力均較高的蒜酶原料。 第三大蒜蒜酶的酶學性質(zhì)及其催化動力學特性研究。利用中試產(chǎn)品，在對大蒜蒜酶的酶學性質(zhì)研究中，以天然蒜氨酸為底物，采用丙酮酸法測定蒜酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒜酶具有熱

7、不穩(wěn)定性和pH不穩(wěn)定性；其酶解反應選擇在35℃和pH7.00的緩沖體系中最佳；蒜酶溶解后，若放置較長時間，應選擇在低溫(≤5℃)和pH6.5的緩沖體系中為宜。臨床常用溶劑中，含氯化鈉的注射液(不含葡萄糖)對蒜酶活力有顯著的激活作用，而含有葡萄糖的注射液則強烈抑制蒜酶活力。顯然，臨床應用時，含有葡萄糖的注射液不宜作為蒜酶的配伍溶液。75％和95％乙醇作為消毒液使用時也應避免其對蒜酶的殺傷作用。在對大蒜蒜酶/蒜氨酸催化動力學研究中，采用丙酮