Levan及硫酸化levan的制備和抗腫瘤活性的研究.pdf

1、腫瘤是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病。近年來(lái)，惡性腫瘤的發(fā)病率急劇上升，己占人類(lèi)死因的第二位，是當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的一類(lèi)疾病。研究腫瘤的防治對(duì)策是擺在全世界科學(xué)工作者面前的重要任務(wù)。腫瘤的傳統(tǒng)治療方式具有風(fēng)險(xiǎn)大、耗資高、藥物的選擇性差、毒副作用強(qiáng)、增加病人痛苦等特點(diǎn)，因此高效、低毒、特異性強(qiáng)的新型抗癌藥物已成為當(dāng)今抗腫瘤藥物研究開(kāi)發(fā)的重要方向。目前，抗腫瘤藥物正從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物向針對(duì)機(jī)制的多環(huán)節(jié)作用的新型抗腫瘤藥物發(fā)展。
　　

2、糖類(lèi)化合物具有多種生物活性，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，許多糖類(lèi)還具有顯著的抗腫瘤活性，且其作用機(jī)制多樣，如調(diào)整機(jī)體免疫間接發(fā)揮抗腫瘤活性、影響腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、干擾腫瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等。同時(shí)，針對(duì)糖類(lèi)化合物衍生物的研究顯示，糖的硫酸酯等衍生物往往表現(xiàn)出比起母體糖更為顯著的生物活性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能和抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮抗腫瘤作用的某些新型糖類(lèi)化合物，具有藥效強(qiáng)、毒副作用小等特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用

3、前景。
　　 Levan是一種主要由β-2，6-鍵連接的呋喃果糖殘基作為主鏈，以一些β-2，1-鍵連接作為分支點(diǎn)所組成的微生物果聚糖。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，levan具有抗腫瘤的活性，但是其作用機(jī)制還不清楚。本課題在前期工作的基礎(chǔ)上，選用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌發(fā)酵產(chǎn)物levan作為原料，對(duì)其進(jìn)行部分水解和硫酸化并加以分離，制得不同分子量和不同硫酸化程度的levan，體外實(shí)驗(yàn)篩選出具有免疫增強(qiáng)和抗腫瘤血管生成活性的組分L-1和PSL-6，并進(jìn)

4、一步研究其體內(nèi)體外抗腫瘤活性。為了闡明其潛在的抗腫瘤機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了L-1和PSL-6對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IL-12和TNF-α的影響，L-1和PSL-6對(duì)腫瘤細(xì)胞分泌血管生成相關(guān)生長(zhǎng)因子VEGF和MMP-2的影響；通過(guò)H22荷瘤小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)考察了L-1和PSL-6對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用、脾臟和胸腺的增殖作用，ELISA測(cè)定了抗腫瘤活性相關(guān)細(xì)胞因子IL-12和TNF-α,分泌的影響，免疫組化實(shí)驗(yàn)測(cè)定了對(duì)腫瘤血管生成相關(guān)生長(zhǎng)因子VE

5、GF和MMP-2的影響。
　　 本研究取得的結(jié)果和結(jié)論有以下幾個(gè)方面：
　　 1.Levan和PSL的制備和分離純化優(yōu)化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)，發(fā)酵制得胞外多糖levan，苯酚硫酸法測(cè)得總糖含量為(76.86±2.29)％，TLC和GC單糖組分分析的結(jié)果顯示，levan為一種胞外果聚糖。將levan弱酸水解后，利用SephacralＴＭS-300凝膠層析柱分離，獲得相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)分分布范圍不同的5個(gè)組

6、分，初次分離的組分為L(zhǎng)-1、L-2、L-3、L-4、L-5，凝膠層析對(duì)L－1、L-2、L-3、L-4進(jìn)行二次分離，進(jìn)一步純化而獲得分子量相對(duì)單一的組分。多角度激光散射技術(shù)測(cè)定分子量分別為407kD、259kD、157.79kD、22.97kD、10.89kD。
　　 采用氯磺酸.甲酰胺法對(duì)levan進(jìn)行硫酸化修飾后，得到PSL混合物，經(jīng)過(guò)QFF離子交換層析分離得到不同硫酸化程度的組分PSL-1、PSL-2、PSL-3、PSL-4

7、、PSL-5、PSL-6。多角度激光散射技術(shù)測(cè)定分子量分別為6，537D、5，878D、5，097D、2，890D、1,248D、1，109D，氯化鋇-明膠法測(cè)定其硫酸根含量分別為(8.38±0.91)％、(11.69±0.86)％、(18.93±0.87)％、(27.64±0.91)％、(33.37±0.86)％、（42.3±0.91）％。
　　 2.篩選具有免疫增強(qiáng)活性和抗血管生成活性的組分采用體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞、脾臟細(xì)胞

8、的增殖實(shí)驗(yàn)篩選具有免疫增強(qiáng)活性的組分，結(jié)果顯示，levan各組分中活性最強(qiáng)的是L-1，其次為L(zhǎng)-3:PSL各組分中活性最強(qiáng)的為PSL-6，其次為PSL-5。采用體外培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖實(shí)驗(yàn)篩選具有抗腫瘤活性的組分，結(jié)果顯示，levan各組分中活性最強(qiáng)的是L-2，其次為L(zhǎng)-1:PSL各組分中活性最強(qiáng)的為PSL-6，其次為PSL-5。采用ELISA測(cè)定人卵巢癌SKOV3細(xì)胞VEGF的表達(dá)實(shí)驗(yàn)篩選具有抗血管生成活性的組分，結(jié)果顯示

9、，levan各組分中活性最強(qiáng)的是L-1，其次為L(zhǎng)-3;PSL各組分中活性最強(qiáng)的為PSL-5，其次為PSL-4和PSL-6。綜合結(jié)果選擇L-1和PSL-6進(jìn)行進(jìn)一步的抗腫瘤活性研究。
　　 3.體外實(shí)驗(yàn)研究L-1和PSL-6對(duì)免疫相關(guān)因子和抗血管生成相關(guān)因子的影響采用L-1和PSL-6與小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)測(cè)定細(xì)胞上清液中IL-12和TNF-α的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-1和PSL-6均具有較強(qiáng)的增強(qiáng)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的作用，能夠調(diào)節(jié)巨

10、噬細(xì)胞的免疫功能，且具有劑量依賴(lài)性。L-1和PSL-6對(duì)IL-12分泌的最大增長(zhǎng)率分別為(3.46±0.19)、(5.30±0.12)倍；L-1和PSL-6對(duì)TNF-α分泌的最大增長(zhǎng)率分別為(2.17±0.016)、(2.72±0.020)倍。L-1、PSL-6對(duì)IL-12分泌的促進(jìn)作用要強(qiáng)于TNFα。綜合L-1和PSL-6對(duì)IL-12和TNF-α的上調(diào)作用來(lái)看，L-1的作用小于PSL-6。
　　 通過(guò)L-1和PSL-6人卵巢癌

11、細(xì)胞SKOV3分泌VEGF和表達(dá)MMP-2的研究發(fā)現(xiàn)，L-1和PSL-6均具有較強(qiáng)的抑制SKOV3分泌VEGF和表達(dá)MMP-2作用，下調(diào)了腫瘤血管生成中至關(guān)重要的血管生成因子和基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)的水平。經(jīng)過(guò)24h的處理后，L-1和PSL-6對(duì)VEGF分泌的最大抑制率可以達(dá)到：（64.88±1.93）％、（44.00±0.83）％；48h后，L-1和PSL-6對(duì)VEGF分泌的最大抑制率為(77.97±1.35)％、(66.63±1.37)％

12、:72h后，L-1和PSL-6對(duì)VEGF分泌的最大抑制率為(78.96±1.57)％、(83.31±1.86)％。L-1和PSL-6的這種抑制作用均具有劑量依賴(lài)性和一定的時(shí)效依賴(lài)性。用Westernbloting測(cè)定MMP-2的表達(dá)，結(jié)果顯示，在L-1、PSL-6終濃度為50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL和500μg/mL作用72h后，二者對(duì)人SKOV3卵巢癌細(xì)胞MMP-2表達(dá)均有明顯的抑制作用，并且具有一定的量效關(guān)系。

13、L-1與PSL-6相比，PSL-6具有更強(qiáng)的抑制作用。
　　 4.H22荷瘤小鼠體內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定L-1和PSL-6的抗腫瘤活性小鼠腋下注射H22瘤細(xì)胞，隨機(jī)分組后，給予不同劑量的L-1和PSL-6，培養(yǎng)14d，測(cè)定荷瘤小鼠的腫瘤抑制率、瘤重/體重、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、外周血IL-12和TNF-α含量以及對(duì)腫瘤組織中VEGF、MMP-2表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究二者的抗腫瘤作用和可能的機(jī)制。結(jié)果顯示，L-1和PSL-6的低、中、高劑量組均

14、能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為：（20.5±0.14）％、(31.65±0.10)％、(39.9±0.16)％、（33.28士0.12)％、(39.34±0.07)％、(42.52±0.08)％;將腫瘤組織進(jìn)行切片、HE染色后進(jìn)一步觀察其病理形態(tài)，鏡檢發(fā)現(xiàn)，L-1和PSL-6能顯著地抑制腫瘤的生長(zhǎng)，在腫瘤組織邊緣及內(nèi)部均有大量壞死區(qū)域。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，L-1和PSL-6均能夠顯著地增大胸腺和脾臟指數(shù)，顯著地增加小鼠外周血中IL-12和

15、TNF-α的含量，對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)具有促進(jìn)作用。L-1對(duì)促進(jìn)免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子的分泌作用更強(qiáng)，而PSL-6對(duì)促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖的作用更強(qiáng)，提示二者雖然都能夠增強(qiáng)免疫，但是他們的作用機(jī)制存在差異。免疫組化的結(jié)果顯示，L-1和PSL-6能夠顯著地抑制腫瘤組織VEGF和MMP-2的表達(dá)，隨著給藥濃度的增加，這種抑制作用增強(qiáng)，具有明顯的劑量依賴(lài)性。同濃度下，L-1和PSL-6相比，二者的抑制作用并沒(méi)有顯著性的差異。
　　 5.本課題取得的主

16、要成果：
　　 (1)首次將微生物發(fā)酵的levan進(jìn)行了降解和硫酸化，分離制得不同分子量和不同硫酸化程度的L和PSL各組分。
　　 (2)篩選出具有免疫增強(qiáng)活性和抗血管生成活性的組分，并發(fā)現(xiàn)PSL也具有與levan相似的和免疫增強(qiáng)活性和抗血管生成活性。
　　 (3)首次發(fā)現(xiàn)levan和PSL具有抗腫瘤血管生成的作用，初步探討了其作用的靶點(diǎn)是VEGF和MMP-2。
　　 (4)首次進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)荷瘤