廣譜半胱天冬酶抑制劑Q-VD-OPH治療椎間盤退變的實驗研究.pdf

1、第一部分、纖維環(huán)和髓核細胞原代培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:探討兔纖維環(huán)和髓核細胞的分離、體外培養(yǎng)方法，并對細胞表型進行鑒定。方法:采用酶消化法分離兔纖維環(huán)和髓核組織，進行單層培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細胞生長和形態(tài)學(xué)變化，甲苯胺藍染色檢測纖維環(huán)和髓核細胞內(nèi)聚集蛋白聚糖的表達，免疫細胞化學(xué)法對纖維環(huán)細胞行Ⅰ、Ⅱ型膠原以及堿性磷酸酶染色，對髓核細胞行Ⅱ型膠原染色。結(jié)果:采用0.25％胰蛋白酶加粗品膠原酶可較好的分離培養(yǎng)出兔纖維環(huán)和髓核細胞

2、。原代纖維環(huán)細胞多呈梭形或三角形，甲苯胺藍染色呈陽性，Ⅰ、Ⅱ型膠原以及堿性磷酸酶染色均可見陽性表達；原代髓核細胞呈類圓形、短梭形或三角形，甲苯胺藍染色呈陽性，Ⅱ型膠原染色可見陽性表達。結(jié)論:采用0.25%胰蛋白酶加粗品膠原酶消化法體外成功培養(yǎng)出兔纖維環(huán)和髓核細胞；纖維環(huán)細胞和髓核細胞呈類軟骨表型，纖維環(huán)細胞合成分泌聚集蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型膠原，髓核細胞合成分泌聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白。
　　 第二部分、髓核和纖維環(huán)細胞凋亡途徑的

3、實驗研究
　　 目的:明確椎間盤纖維環(huán)細胞和髓核細胞的凋亡途徑。方法:取原代培養(yǎng)的纖維環(huán)細胞和髓核細胞，分別建立2個實驗組:原代細胞+10%血清培養(yǎng)基，原代細胞+0%血清培養(yǎng)基。分別共培養(yǎng)48小時后采用流式細胞儀測定纖維環(huán)和髓核細胞的凋亡率，并分別以試劑盒和Westernblot法測定細胞凋亡過程中產(chǎn)生的caspase3、8、9以及細胞色素C和Bid蛋白量的變化。結(jié)果:與10%血清培養(yǎng)的細胞相比，0%血清培養(yǎng)48小時的纖維環(huán)細胞

4、和髓核細胞均經(jīng)歷了明顯的凋亡(P＜0.01)。纖維環(huán)細胞凋亡過程中caspase3、8酶的量顯著增加(P＜0.01)，而caspase9、細胞色素C和Bid蛋白的量變化不明顯;而髓核細胞凋亡的過程中，caspase3、9酶以及細胞色素C和Bid蛋白的量顯著增加(P＜0.01)，而caspase8酶的量變化不明顯。結(jié)論:纖維環(huán)細胞和髓核細胞凋亡的途徑不同，纖維環(huán)細胞是通過細胞表面死亡受體途徑實現(xiàn)細胞凋亡的，而髓核細胞是通過線粒體途徑實現(xiàn)細

5、胞凋亡的。
　　 第三部分、Q-VD-OPH對體外培養(yǎng)纖維環(huán)及髓核細胞凋亡的影響
　　 目的:研究廣譜半胱天冬酶抑制劑Q-VD-OPH對體外培養(yǎng)的纖維環(huán)和髓核細胞凋亡的影響，并檢測其對caspase3、8、9酶活性的影響，以明確其對椎間盤纖維環(huán)和髓核細胞凋亡的抑制作用。方法:取原代培養(yǎng)的纖維環(huán)細胞和髓核細胞，分別建立3個實驗組:原代細胞+10%血清培養(yǎng)基，原代細胞+1%血清培養(yǎng)基，原代細胞+1%血清培養(yǎng)基+50μMQ-V

6、D-OPH，分別培養(yǎng)24、48、72h以后以流式細胞儀測定纖維環(huán)和髓核細胞的凋亡率，以Westernblot檢測BCL-2/BAX比值，并以試劑盒檢測caspase3、8、9酶的活性。結(jié)果:與10%血清培養(yǎng)的纖維環(huán)細胞和髓核細胞相比，1%血清培養(yǎng)的細胞均經(jīng)歷了明顯的凋亡(P＜0.01)。但在各個時間點，加入Q-VD-OPH的細胞凋亡率均明顯降低，與1%血清培養(yǎng)的細胞有非常顯著性差別(P＜0.01)。加入Q-VD-OPH后，纖維環(huán)細胞中的

7、caspase3、8酶和髓核細胞中的caspase3、9酶的活力均明顯降低，與1%血清培養(yǎng)的纖維環(huán)和髓核細胞相比有非常顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)論:廣譜半胱天冬酶抑制劑Q-VD-OPH能降低纖維環(huán)細胞凋亡過程中產(chǎn)生的caspase3、8酶以及髓核細胞凋亡過程中產(chǎn)生的caspase3、9酶的活性，從而有效地預(yù)防纖維環(huán)細胞和髓核細胞的凋亡。
　　 第四部分、Q-VD-OPH對兔體內(nèi)椎間盤細胞凋亡的影響
　　 目的:采用1

8、8G穿刺針穿刺椎間盤，誘導(dǎo)兔椎間盤退變建立動物模型，并在造模同時注入廣譜半胱天冬酶抑制劑Q-VD-OPH，以觀察其對椎間盤退變的影響。方法:新西蘭大白兔32只，用18G穿刺針穿刺L3/4、L4/5及L5/6椎間盤，以自制深度控制器控制穿刺深度為5mm。分別建立4個實驗組:A組正常椎間盤;B組單純行穿刺組;C組穿刺同時注入5ul生理鹽水;D組穿刺同時注入5ulQ-VD-OPH。分別在術(shù)后2、4、6、8周將大白兔處死取材，以流式細胞儀測定椎

9、間盤細胞凋亡率，并以caspase3試劑盒測定各組caspase3量的變化。結(jié)果：流式細胞儀結(jié)果提示，與正常椎間盤相比，穿刺組、穿刺+生理鹽水組和穿刺+Q-VD-OPH組的椎間盤細胞均經(jīng)歷了明顯的凋亡，但穿刺+Q-VD-OPH組在2、4、6、8周時椎間盤細胞凋亡率均較其余兩組細胞凋亡率明顯降低(P＜0.01)。與正常椎間盤相比，在各個時間點的穿刺組和穿刺+生理鹽水組椎間盤caspase3活力均有非常顯著性增加，而穿刺后加入Q-VD-OP