iASPP調控頭頸鱗癌生長增殖、侵襲及化療敏感性的實驗研究.pdf

1、全球每年大約有50多萬頭頸鱗癌(Head and Neck SquamousCell Carcinoma，HNSCC)的新發(fā)患者，而每年全球因頭頸鱗癌而死亡的患者達20萬左右[1，2]。目前，頭頸鱗癌的治療方式主要以手術治療為主，放療、化療及分子靶向治療等其他治療方式為輔[3]。盡管各種治療手段都在不斷的更新和進步，但是頭頸鱗癌患者的五年生存率并沒有因此而得到顯著的提高，依然嚴重危害著人類的健康和生命[4]。那么，是什么因素促進了頭頸鱗

2、癌的發(fā)生發(fā)展，并使現(xiàn)有的治療方式陷入窘境？目前認為和多種實體瘤一樣，頭頸鱗癌在發(fā)生發(fā)展過程中歷經了一系列的基因改變，因此，從分子基因水平研究頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展機制，并尋找該過程中起關鍵作用的調控因子，從而進行針對性的預防、干預和控制，是早期診斷及有效預防和治療頭頸鱗癌的關鍵[5，6]。
　　iASPP(inhibitory member of the ASPPfamily)是 ASPP(ankyrin-repeat, SH3-do

3、main and prolinerichdomain protein)即P53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimulating protein of P53)家族中的抑制成員，它能競爭性地與P53結合，抑制P53的抑癌功能，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的癌蛋白。目前研究表明，iASPP在乳腺癌[7]、白血病[8]、肝癌[9]、卵巢癌[10]等多種惡性腫瘤中表達升高，它通過促進腫瘤細胞的增殖并抑制其凋亡進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，迄今為

4、止，國內外尚未見iASPP在頭頸鱗癌中的報道，因此，本研究擬探討其在頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用及對化療敏感性的影響。
　　第一章、iASPP在頭頸鱗癌中的表達及其臨床意義
　　目的:檢測iASPP mRNA及蛋白在頭頸部鱗狀細胞癌（頭頸鱗癌）組織及細胞株中的表達，并探討其表達與頭頸鱗癌患者臨床病理特征及預后之間的關系。
　　方法:采用免疫組織化學技術檢測iASPP蛋白在109例頭頸鱗癌石蠟組織標本和15例癌旁組織標本中的

5、表達，并統(tǒng)計分析iASPP蛋白的表達與頭頸鱗癌患者臨床病理特征及預后之間的關系;同時，運用熒光定量RT-PCR及Western blot方法檢測iASPP mRNA及蛋白在16例配對頭頸鱗癌組織及癌旁粘膜組織中的表達;此外還采用Western blot方法檢測iASPP蛋白在7株頭頸鱗癌細胞株和人口腔粘膜癌前病變細胞株DOK中的表達情況。
　　結果:iASPP蛋白在頭頸鱗癌組織及細胞株中的表達均上調，且iASPP蛋白在腫瘤細胞胞漿

6、和胞核中均有表達。進一步統(tǒng)計分析表明胞漿iASPP蛋白和胞核iASPP蛋白的表達與頭頸鱗癌患者的T分級（T1+T2/T3+T4）(P=0.002，P=0.033)、臨床分期（Ⅰ期+Ⅱ期/Ⅲ期+Ⅳ期）(P＜0.001，P=0.004)、淋巴結轉移(P=0.001，P＜0.001)及復發(fā)（兩者均P＜0.001）密切相關;Kaplan-Meier生存分析結果顯示iASPP高表達組與低表達組的5年無病生存率及5年總生存率之間的差異具有統(tǒng)計學意義

7、（P均＜0.001）;多因素Cox比例風險回歸模型進一步表明，胞漿iASPP蛋白的表達水平是頭頸鱗癌預后的獨立影響因素(P＜0.05)。同時，熒光定量RT-PCR及Western blot結果顯示iASPPmRNA及蛋白在頭頸鱗癌組織的表達顯著高于其在癌旁粘膜中的表達，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001，P=0.002)。
　　結論:iASPP在頭頸鱗癌組織及細胞中的表達顯著升高，且其高表達與頭頸鱗癌患者的T分級、臨床分期、淋巴

8、結轉移、復發(fā)及預后密切相關。這些結果均提示iASPP可能在頭頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，并且有望成為早期診斷和評估頭頸鱗癌患者預后的重要分子標志物。
　　第二章、沉默iASPP基因的表達對頭頸鱗癌細胞生長增殖、凋亡、周期和侵襲能力的影響
　　目的:觀察沉默iASPP基因表達后，對頭頸鱗癌細胞生長增殖、凋亡、周期及侵襲能力等生物學行為的影響。
　　方法:采用慢病毒介導的iASPP shRNA感染頭頸鱗癌Tu68

9、6細胞，用嘌呤霉素篩選并建立穩(wěn)定沉默iASPP基因的Tu686細胞，熒光定量RT-PCR和Western blot技術檢測iASPP基因的沉默效果;采用CCK-8法、流式細胞術、Transwell侵襲實驗檢測沉默iASPP基因表達后，對頭頸鱗癌Tu686細胞的體外生長增殖能力、細胞凋亡和細胞周期分布及侵襲能力的影響。
　　結果:
　　1.慢病毒介導的iASPP shRNA有效地抑制了頭頸鱗癌Tu686細胞中iASPP基因的表

10、達，并成功建立了穩(wěn)定沉默iASPP基因的Tu686細胞。
　　2.CCK-8檢測結果顯示iASPP基因沉默后能顯著抑制Tu686細胞的體外增殖能力。自72h時間點開始(72h、96h、120h)LV-shiASPP細胞（穩(wěn)定表達iASPP shRNA基因片段的Tu686細胞）的OD值顯著低于對照組UT細胞（未處理的Tu686親本細胞）和LV-shNon細胞（穩(wěn)定表達Control shRNA基因片段的Tu686細胞）的OD值(P均

11、＜0.01)。而在每個檢測時間點上UT細胞和LV-shNon細胞的OD值間相比均無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。
　　3.流式細胞術檢測結果顯示沉默iASPP基因表達后，LV-shiASPP細胞的凋亡率較對照組UT和LV-shNon細胞明顯增多（9.42±0.39％ vs2.80±0.42％，3.18±0.28％），其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。同時發(fā)現(xiàn)LV-shiASPP細胞中處于G0/G1期的細胞比例較對照組UT和LV

12、-shNon細胞顯著增多（74.65±1.09％ vs55.19±1.02％，54.62±0.88％）(P＜0.01)，而處于S期（17.54±1.21％ vs32.56±0.98％，32.50±1.17％）(P＜0.01)和G2/M期(7.81±0.76％ vs12.24±0.68％，12.87±0.31％)(P＜0.01)的細胞比例顯著減少，而UT和LV-shNon兩對照組細胞之間的周期分布無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　

13、4.沉默iASPP基因表達后，Tu686的侵襲能力顯著減弱。Transwell侵襲實驗顯示48小時后穿過Transwell侵襲小室聚碳酸酯膜的LV-shiASPP細胞較兩對照組UT細胞和LV-shNon細胞明顯減少(56±4vs111±3，105±8)(P＜0.01)，而兩對照組間的差異不明顯(P＞0.05)。
　　結論:沉默iASPP的表達，能促進細胞凋亡，誘導G0/G1期捕獲，從而抑制Tu686細胞體外生長增殖能力，并減弱其侵

14、襲能力，提示iASPP在頭頸鱗癌的發(fā)生及惡性進展中發(fā)揮了重要的作用。
　　第三章、沉默iASPP基因的表達對頭頸鱗癌細胞紫杉醇化療敏感性的影響
　　目的:探討沉默iASPP基因的表達后，對頭頸鱗癌Tu686細胞紫杉醇化療敏感性的影響。
　　方法:以不同濃度的紫杉醇藥物作用于UT細胞、LV-shNon細胞和LV-shiASPP細胞，48小時后，采用CCK-8法檢測各組細胞生長增殖情況，繪制各組細胞的生存曲線，計算各組細胞

15、紫杉醇作用的IC50值，及紫杉醇作用UT細胞的IC30值。以紫杉醇IC30濃度處理UT細胞、LV-shiASPP細胞和LV-shNon細胞，24小時后行流式細胞術檢測三組細胞凋亡和細胞周期情況。
　　結果:
　　1.LV-shiASPP細胞、UT細胞和LV-shNon細胞紫杉醇作用的IC50值分別為3.84±0.28 nM/L，47.46±2.12 nM/L和50.93±2.27 nM/L，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01

16、)，表明LV-shiASPP細胞對紫杉醇的化療敏感性明顯較對照組UT細胞和LV-shNon細胞增強，而UT細胞和LV-shNon細胞紫杉醇作用的IC50值相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.以UT細胞紫杉醇作用的IC30濃度分別作用于三組細胞，流式細胞術檢測結果顯示LV-shiASPP細胞的凋亡率較UT和LV-shNon細胞明顯增多（18.27±1.13％ vs7.31±0.33％，8.20±0.34％），且差異具有

17、統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。同時，LV-shiASPP細胞中處于G2/M期的細胞比例較UT和LV-shNon細胞顯著增多（28.68±0.76％vs19.21±0.89％，17.99±0.13％）(P＜0.01)，而處于S期的細胞比例顯著減少（15.11±1.09％ vs26.38±2.04％，26.58±0.67％）(P＜0.01)，G0/G1期細胞比例變化不大（56.21±1.82％ vs54.41±1.15％，55.42±0.56