枯草芽孢桿菌BSD-2誘導(dǎo)黃瓜抗灰霉病作用機理研究.pdf

1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的內(nèi)生孢子，對多種病害病原菌產(chǎn)生抑制作用，是一種理想的生防菌。前期分離篩選到的植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌BSD-2，對蔬菜灰霉病、葉霉病、枯萎病等多種植物病原菌有較強的抑制作用。本文主要從BSD-2抗菌物質(zhì)的分離、防病效果、誘導(dǎo)黃瓜抗灰霉病機理等方面進行研究。
　　對枯草芽孢桿菌BSD-2代謝所產(chǎn)抑菌物質(zhì)進行初步分離，得到最佳條件為鹽酸調(diào)pH至2.5

2、，60％濃度的乙醇對沉淀進行抽提，抽提所得物質(zhì)采用葡聚糖凝膠G-50進一步分離收集到兩個峰的物質(zhì)，其中第二個峰收集的物質(zhì)對黃瓜灰霉病菌具有良好抑制作用。風(fēng)干后沉淀溶于磷酸緩沖液中冷凍干燥得到枯草芽孢桿菌BSD-2代謝產(chǎn)物中的抗菌物質(zhì)粗提物抗菌素。
　　枯草芽孢桿菌BSD-2及其抗菌物質(zhì)對黃瓜灰霉病的防病效果測定結(jié)果表明，發(fā)酵液處理的防病效果最佳，其次為抗菌素和芽孢稀釋溶液處理，且兩者效果差異不顯著。稀釋50倍的發(fā)酵液、稀釋10倍的

3、抗菌素、108cfu/mL芽孢稀釋溶液的效果最好，防病效果分別達到了62.3％、52.9％、56.1％。
　　枯草芽孢桿菌BSD-2及其抗菌物質(zhì)處理后抗病相關(guān)防御酶和幾丁質(zhì)酶的測定結(jié)果顯示，發(fā)酵液、抗菌素和芽孢稀釋溶液處理能夠提高POD、PPO、PAL、SOD的酶活性，且均在5天時達到酶活高峰，其中POD酶活性分別是對照處理的1.23、1.06、1.51倍;PPO酶活性在發(fā)酵液與抗菌素處理初期變化趨勢明顯，峰值為190U/g·mi

4、n和170U/g·min，均達到對照處理的數(shù)值的3倍以上;PAL酶活性分別是對照組處理的1.68、1.67、1.68倍;SOD酶活性分別為對照處理的1.31、1.28、1.23倍。CAT酶活在發(fā)酵液和抗菌素處理后第3天時便達到峰值，活性分別達到103.5U/g·min和107.5U/g·min。發(fā)酵液、抗菌素、芽孢稀釋溶液處理后幾丁質(zhì)酶活在11天時達到峰值，分別是對照的1.99、1.49、1.95倍?？梢娍莶菅挎邨U菌BSD-2及其抗菌物

5、質(zhì)可以提高相關(guān)防御酶(POD、PPO、PAL、SOD、CAT)以及病程相關(guān)蛋白（幾丁質(zhì)酶），加快抗病相關(guān)物質(zhì)的合成，進而誘導(dǎo)黃瓜植株產(chǎn)生抗病作用。
　　發(fā)酵液、抗菌素、芽孢稀釋溶液處理后葉片中的POD同工酶以及胞間隙蛋白測定結(jié)果顯示，葉片中的POD同工酶表達發(fā)生變化，不僅表現(xiàn)在同種同工酶表達量的改變，同工酶種類也相應(yīng)地增加。處理后胞間隙液中的幾丁質(zhì)酶酶活上升，在9天時分別達到為對照的1.32、1.39、1.46倍，且葉片胞間隙蛋白

6、電泳中出現(xiàn)大小約為27kD的新增蛋白條帶?？梢夿SD-2及其抗菌物質(zhì)能夠誘導(dǎo)植物自身防御基因與相關(guān)蛋白的表達，從而誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生對灰霉病的抗病作用。
　　初步建立了黃瓜葉片蛋白的雙向電泳體系，分析BSD-2及其抗菌物質(zhì)處理后的葉片蛋白變化。條件優(yōu)化結(jié)果表明:丙酮/三氯乙酸法提取方法有利于獲得豐富度較高的蛋白質(zhì)溶液。300μg上樣量、pH3-10的IPG預(yù)制膠條和25000Vhr的聚焦條件能夠獲得較為理想的雙向電泳圖譜。差異圖譜顯示部