大麥黃矮病毒GAV株系和小麥黃花葉病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用.pdf

1、在我國小麥是僅次于水稻的第二大糧食作物，其安全生產(chǎn)關(guān)乎民生。近年來，小麥上的病毒病發(fā)生較重，尤其是大麥黃矮病毒(Barleyyellow dwarf virus，BYDV)引起的小麥黃矮病和小麥黃花葉病毒(Wheatyellow mosaic virus，WYMV)引起的小麥黃花葉病，造成小麥嚴重減產(chǎn)和巨大經(jīng)濟損失。目前，侵染我國小麥的小麥黃矮病主要由BYDVGAV株系引起。為了了解這兩種病毒病的發(fā)生、流行規(guī)律、建立早期監(jiān)測和預(yù)警體系，

2、急需建立快速、高效的病毒檢測方法。以單克隆抗體為核心建立的血清學(xué)檢測方法操作簡單、特異性好、靈敏度高，且適合田間大規(guī)模樣品檢測，因此被廣泛應(yīng)用于植物病毒的診斷、流行規(guī)律的分析、預(yù)測預(yù)警、科學(xué)防控和抗病育種等方面。本論文分別制備了抗BYDVGAV株系和WYMV的單克隆抗體(Monoclonal antibodies，MAbs)，并以單抗為核心建立了相應(yīng)的血清學(xué)檢測方法。
　　(1)抗BYDV GAV單克隆抗體的制備及其檢測應(yīng)用:用提

3、純的BYDV GAV病毒粒子免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細胞融合、篩選、克隆獲得8株能穩(wěn)定傳代并分泌抗BYDVGAV單克隆抗體的雜交瘤細胞株（18A1、18A9、12A11、7H11、1G7、1F1、27E1和3F11）。8株雜交瘤細胞分泌的腹水單抗的間接ELISA效價均達到10-6以上，抗體類型及亞類均為IgG1、kappa鏈。8株單抗具有特異性好、靈敏度高的特點。以制備的單抗為核心建立了特異性檢測BYDV GAV的Antigen-coa

4、ted plate enzyme-linked immunosorbent assay(ACP-ELISA)和dot enzyme-linked immunosorbent assay(dot-ELISA)兩種血清學(xué)方法。建立的血清學(xué)方法檢測感染BYDV GAV的小麥組織呈特異性陽性反應(yīng)，而檢測感染其他病毒的小麥和健康小麥組織呈陰性反應(yīng)。用dot-ELISA方法檢測攜帶BYDV GAV的麥蚜呈特異性陽性反應(yīng)，而檢測攜帶其他病毒的麥蚜和健

5、康麥蚜呈陰性反應(yīng)。靈敏度分析表明:ACP-ELISA和dot-ELISA檢測小麥病葉的靈敏度分別達到1∶81，920和1∶5，120(w/v，g/mL)。利用ACP-ELISA和dot-ELISA兩種血清學(xué)方法對陜西韓城采集的106株小麥樣品進行檢測，結(jié)果表明106株小麥樣品中有64株為BYDV GAV感病樣品，說明小麥黃矮病在陜西韓城發(fā)生流行。利用dot-ELISA血清學(xué)方法對田間采集的280頭麥蚜進行檢測，結(jié)果表明其中有24頭蚜蟲攜

6、帶BYDV GAV。
　　(2)抗WYMV單克隆抗體的制備及其檢測應(yīng)用:以提純的WYMV的病毒粒子為抗原免疫BALB/c小鼠，用雜交瘤技術(shù)共篩選到3株能穩(wěn)定傳代并分泌抗WYMV單克隆抗體的雜交瘤細胞株4E11、21D4和25B1。3株雜交瘤細胞分泌的單抗腹水的間接ELISA效價均達到10-6以上，抗體類型及亞類均為IgG1、kappa鏈。Western blot分析表明，4E11和21D4均能與WYMV的外殼蛋白亞基有特異性反應(yīng)。

7、以制備的單抗為核心建立了檢測田間小麥樣品中WYMV的ACP-ELISA和dot-ELISA方法。建立的ACP-ELISA和dot-ELISA兩種方法檢測感染W(wǎng)YMV的小麥病葉組織呈特異性陽性反應(yīng)，而檢測感染其他病毒的小麥和健康小麥組織呈陰性反應(yīng)。ACP-ELISA和dot-ELISA方法檢測感染W(wǎng)YMV的小麥植物組織的靈敏度分別達到1∶40，960和1∶2，560(w/v，g/mL)。利用ACP-ELISA和dot-ELISA兩種血清學(xué)