番茄中microRNA的功能和應(yīng)用研究.pdf

1、MicroRNA是植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)的重要調(diào)節(jié)元件。對(duì)microRNA加以改造使之產(chǎn)生新的靶向功能,稱(chēng)之人工microRNA。人工microRNA在遺傳學(xué)研究和植物基因工程上有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 在植物中表達(dá)識(shí)別病毒RNA序列的人工miRNA可以結(jié)合并降解病毒RNA基因組,從而產(chǎn)生對(duì)病毒的抗性。CMV病毒是一種極具侵染力的病毒,在番茄生產(chǎn)上造成嚴(yán)重?fù)p失。本研究設(shè)計(jì)了兩個(gè)人工miRNA,分別識(shí)別CMV病毒2a/2b基因編碼

2、區(qū)重疊部位和病毒RNA基因組的3’非翻譯區(qū)的的保守區(qū)域,并轉(zhuǎn)化番茄感病品種。表達(dá)人工miRNA的轉(zhuǎn)基因番茄表現(xiàn)出高效的CMV抗性,并且在接種非目標(biāo)病毒TMV和TYLCV后仍然保持對(duì)CMV病毒的穩(wěn)定抗性。表明人工miRNA能夠耐受非目標(biāo)病毒的干擾。將轉(zhuǎn)基因接穗嫁接到發(fā)病植株上,顯示出在病毒高壓下持久穩(wěn)定的抗性。通過(guò)嫁接接種實(shí)驗(yàn)表明人工miRNA的抗病模式是細(xì)胞自主性的,不能作為通過(guò)維管束長(zhǎng)距離傳遞的抗病毒信號(hào)分子。本研究培育了兩個(gè)優(yōu)良的抗

3、病毒轉(zhuǎn)基因番茄材料,并解答了人工miRNA抗病毒的幾個(gè)機(jī)理問(wèn)題,為利用人工miRNA培育抗病毒植物提供了一個(gè)成功的案例以供參考和借鑒。
　　 MicroRNA調(diào)控植物多種發(fā)育過(guò)程和生理反應(yīng),包括干旱應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)番茄sly-miR169受干旱誘導(dǎo)表達(dá)。而其4個(gè)靶基因,即3個(gè)NF-YA家族基因(SINF-YA1/2/3)和一個(gè)MRP基因(SIMRP1)的表答在干旱處理時(shí)明顯下降。在番茄植株中組成性表達(dá)sly-miR169家族一個(gè)

4、成員sly-miR169c導(dǎo)致靶基因的表達(dá)量顯著下降。與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晗啾?轉(zhuǎn)基因植株氣孔開(kāi)度、蒸騰速度、離體葉片失水率等顯著降低,在整體上顯示更高的耐旱性。鹽處理發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)NaCl更敏感。由于MRP蛋白參與細(xì)胞離子運(yùn)輸,推測(cè)sly-miR169通過(guò)調(diào)控氣孔保衛(wèi)細(xì)胞離子運(yùn)輸控制氣孔開(kāi)關(guān)。序列的進(jìn)化樹(shù)分析顯示MRP1基因在種子植物中是miR169的一個(gè)古老靶基因,但其miRNA識(shí)別位點(diǎn)產(chǎn)生的一些新的突變使得該基因在一些物種中逐漸脫

5、離miR169的控制。
　　 miRNA156是一個(gè)植物特異性的microRNA,在植物發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用。本研究在番茄中超表達(dá)sly-miR156后,SBP-box基因等靶基因在轉(zhuǎn)基因組織中的表達(dá)明顯下調(diào)。轉(zhuǎn)基因植株的株型、葉片、枝條、花序及果實(shí)等多個(gè)性狀產(chǎn)生明顯變化。其中,花序結(jié)構(gòu)等性狀變得與sft突變體表型相似。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SFT基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)明顯降低。由此推斷sly-miR156和SBP-box基因可以通過(guò)調(diào)