ER-AR+乳腺癌細胞中AR活化信號相關miRNA及其靶蛋白的研究.pdf

1、研究背景:
　　作為性激素依賴性的腫瘤，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均居女性惡性腫瘤的首位，一直以來都是腫瘤研究者關注的重點。相對于雌激素受體(estrogenreceptor, ER)和孕激素受體(progesterone receptor, PR)，雄激素受體(androgenreceptor, AR)在乳腺癌生物學中的作用是臨床和基礎研究中被忽略的領域。近年來國外越來越多的實驗研究表明AR與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關。國內(nèi)外

2、的許多文獻報告結果顯示，AR高表達于乳腺癌，在ER陰性的病例有大約1/2的病例AR是陽性的，而且AR陽性乳腺癌患者的臨床過程和預后較好。因此搞清AR在乳腺癌中的作用機制，對進一步認識乳腺癌的生物學行為及發(fā)展新的治療方法有著重要意義。
　　已有的研究表明AR通過與雄激素反應元件結合而活化，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉錄，影響細胞內(nèi)的基因表達程序，包括微小RNA(micro-ribonucleic acid，microRNA，miRNA)的改變

3、，而近年來非編碼的具有重要調(diào)控作用的miRNA正是腫瘤研究領域的熱點，由于miRNA的改變可以負調(diào)控其靶蛋白的表達，因此其既可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性;也可作為癌基因，下調(diào)抑癌基因的活性。
　　我們的前期研究結果顯示，雄激素二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)可以抑制ER-AR+MDA-MB-453乳腺癌細胞增殖，使細胞周期阻滯在G1-S期，提高AR蛋白的表達，miRNA芯片雜交結果篩選出明顯上調(diào)和下

4、調(diào)的miRNA。本研究在前期研究的基礎上，從篩選出的miRNA中找到有意義的2個miRNA進行了深入研究并取得了一些重要發(fā)現(xiàn)。
　　研究目的:
　　1.明確let-7a與AR活化之間的相關性，并對let-7a進行細胞功能學研究，闡明AR活化、let-7a及其靶蛋白在DHT抑制ER-AR+乳腺癌細胞增殖中的重要作用。
　　2.明確miR-30a與AR活化之間的相關性，對miR-30a進行細胞功能學研究，證實其靶蛋白是否為

5、通過生物信息學方法發(fā)現(xiàn)的AR，闡明AR和miR-30a之間的關系及其在DHT抑制ER-AR+乳腺癌細胞增殖中的重要作用。
　　研究方法:
　　1.分析miRNA芯片雜交結果，生物信息學技術預測靶基因為AR的可能miRNA。
　　2.采用實時定量RT-PCR方法，驗證miRNA芯片雜交篩選出的明顯上調(diào)的miRNAlet-7a和明顯下調(diào)的miR-30a，b，c。
　　3.染色質(zhì)免疫沉淀技術證實AR活化與let-7a和

6、miR-30a啟動子的相互作用。
　　4.通過Western blot技術檢測乳腺癌細胞中AR、c-Myc和k-Ras蛋白的表達。
　　5.通過構建質(zhì)粒和細胞轉染實驗使細胞中的miRNA上調(diào)。
　　6.通過轉染miRNA特異性反義寡核苷酸(specific antisense oligonucleotide，ASO)使細胞中的miRNA下調(diào)。
　　7.MTT和流式細胞術方法檢測細胞增殖和細胞周期的變化。
　

7、　8.應用雙熒光蛋白報告基因分析系統(tǒng)證實AR為miR-30a的靶基因。
　　研究結果:
　　1.對miRNA芯片雜交篩選出的miRNA結果進行分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)大于1.5倍，的miRNA有43個，其中包括let-7a,b，c，d，e，g六個，進一步分析發(fā)現(xiàn)只有其中的let-7a，b，c，d為上調(diào)大于2倍，且信號值大于1000的miRNA;下調(diào)大于1.5倍的miRNA有51個，其中包括miR-30a,b，c。
　　2.生物信息

8、學預測軟件預測靶基因為AR的可能的且在miRNA芯片雜交篩選出的有意義的miRNA為miR-30a，b，c。
　　3.對let-7a及miR-30a，b，c進行實時定量RT-PCR，結果顯示let-7a的上調(diào)倍數(shù)近13倍，miR-30a下調(diào)5倍，miR-30b下調(diào)大于2倍，miR-30c下調(diào)接近2倍，選擇上調(diào)的let-7a及下調(diào)的miR-30a進一步研究。
　　4.染色質(zhì)免疫沉淀證實了AR活化后可以直接上調(diào)let-7a，但不

9、直接調(diào)節(jié)miR-30a。
　　5.DHT刺激MDA-MB-453細胞后，c-Myc和k-Ras表達下調(diào)，AR表達上調(diào)。
　　6.實時定量RT-PCR證實細胞轉染成功，與對照組相比，在轉染過表達質(zhì)粒組let-7a和miR-30表達上調(diào)，轉染ASO組let-7a和miR-30表達下調(diào)
　　7.MDA-MB-453細胞轉染后，在let-7a低表達組，細胞增殖活性增高;細胞周期中S期細胞比例增加，G1期細胞比例減少;let-7

10、a的已知靶蛋白c-Myc和k-Ras表達上調(diào)。在let-7a高表達組，則出現(xiàn)相反的結果。
　　8.MDA-MB-453細胞轉染后，在miR-30a低表達組，細胞增殖活性增高;細胞周期中S期細胞比例增加，G1期細胞比例減少，預測的靶蛋白AR表達上調(diào)。在miR-30a高表達組，則出現(xiàn)相反的結果。
　　9.雙熒光蛋白報告基因分析系統(tǒng)證實了AR為miR-30a的靶基因。
　　結論:
　　1.作為轉錄因子AR活化可以作用于

11、let-7a的啟動子直接上調(diào)let-7a。
　　2.AR是miR-30a的靶蛋白，受miR-30a的直接調(diào)控。
　　3.let-7a和miR-30a均為抑癌miRNA。
　　4.雄激素誘導的AR活化直接上調(diào)let-7a，let-7a又下調(diào)其靶蛋白c-Myc和k-Ras，這一信號通路雄激素抑制ER-AR+乳腺癌細胞生長過程中發(fā)揮重要作用。
　　5.miR-30a為抑癌miRNA，而雄激素誘導的AR活化可以下調(diào)miR