去甲基化對香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型及內(nèi)皮祖細(xì)胞功能和干細(xì)胞抗原-1表達(dá)的作用.pdf

1、本文對去甲基化對香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型及內(nèi)皮祖細(xì)胞功能和干細(xì)胞抗原--1表達(dá)的作用進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一章5-雜氮-2'-脫氧胞苷對香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型和干細(xì)胞抗原-1表達(dá)的影響。
　　目的：探討經(jīng)腹腔注射香煙提取物(Cigarette SmokingExtract，CSE)所致肺氣腫小鼠模型的建立，腹腔注射5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，AZA)對肺

2、氣腫動物模型的保護(hù)作用和對干細(xì)胞抗原-1（Stem Cell Antigen-1，Sca-1）表達(dá)的影響。
　　方法：32只4～6周齡的雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對照組（N組）、AZA（A組）、CSE+AZA（AC組）及CSE（C組），每組8只，定時定量腹腔注射CSE溶液/AZA溶液/PBS溶液，第28天處理四組小鼠，檢測體重變化、Buxco系統(tǒng)及PLY3211小動物肺功能檢測系統(tǒng)行肺功能檢查、收集標(biāo)本。肺組織病理切片蘇

3、木素-伊紅（H三）染色后觀察形態(tài)學(xué)改變并定量測定平均肺泡隔厚度(MAST)、平均內(nèi)襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(shù)(DI)，肺組織TUNEL染色檢測肺泡間隔細(xì)胞凋亡。將動物模型于造模第28天處死，密度梯度離心法分離小鼠骨髓EPCs并培養(yǎng)7天，Western Blotting檢測各組EPCs及肺組織Sca-1蛋白表達(dá)，實時定量RT-PCR檢測各組EPCs及肺組織Sca-1 mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴(i)4組小鼠體重變化均無統(tǒng)計學(xué)差

4、異(P＞0.05)。(ii)肺功能比較中，與正常對照組比較，AC組及C組小鼠氣道阻力(Raw)顯著增高(P＜0.01），動態(tài)肺順應(yīng)性(Cdyn)、呼氣峰流速(PEF)及吸呼比(Ti/Te)降低(P＜0.05或P＜0.01)，AC組和C組之間肺功能各指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。(iii)小鼠肺組織HE染色，形態(tài)學(xué)變化明顯，C組肺組織可見肺實質(zhì)破壞，肺泡間隔斷裂，肺泡壁變薄，肺泡腔融合、高度擴(kuò)大，肺氣腫明顯。各組MAST比較:與N組比

5、較，A組、AC組和C組MAST均顯著降低(P＜0.01);與A組比較，AC組和C組MAST顯著降低(P＜0.01);與AC組比較，C組MAST降低(P＜0.05)。各組MLI比較:與N組比較，A組、AC組和C組MAST增高(P＜0.05或P＜0.01);與A組比較，AC組和C組MAST顯著增高(P＜0.01);與AC組比較，C組MAST增高(P＜0.05)。各組DI比較:與N組比較，A組、AC組和C組MAST均顯著增高（P＜0.01）;

6、與A組比較，AC組和C組MAST顯著增高(P＜0.01);與AC組比較，C組MAST增高(P＜0.05)。(iv)肺組織TUNEL染色，與N組比較，AC組和C組AI顯著增高（P＜0.01）;與A組比較，AC組和C組AI顯著增高(P＜0.01);與AC組比較，C組AI顯著增高(P＜0.01)。⑵(i)各組EPCs的Sca-1蛋白表達(dá)比較:與N組比較，AC組和C組Sca-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.01);與A組比較，AC組Sca-1蛋白

7、表達(dá)量降低(P＜0.05)，C組Sea-1蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）;與AC組比較，C組Sca-1蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。(ii)各組EPCs的Sca-1mRNA表達(dá)比較:與N組比較， AC組和C組Sca-1mRNA表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)。與A組比較，AC組和C組Sca-1mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。與AC組比較，C組之間Sca-1mRNA表達(dá)量降低(P＜0.05)。(iii)各組肺組織的Sca-

8、1蛋白表達(dá)比較:與N組比較，A組、AC組和C組Sca-1蛋白表達(dá)量均顯著降低(P＜0.01);與A組比較，AC組和C組Sca-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.01);與AC組比較，C組Sea-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)。(iv)各組肺組織的Sca-1mRNA表達(dá)比較:與N組比較，A組、AC組和C組Sca-1mRNA表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)。與A組比較，AC組和C組Sca-1mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。與AC組比

9、較，C組Sea-1 mRNA表達(dá)量降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：①腹腔內(nèi)注射CSE可成功建立小鼠肺氣腫模型，縮短建模周期，且肺部形態(tài)學(xué)改變早于功能改變。②去甲基化劑可能通過部分逆轉(zhuǎn)CSE對骨髓EPCs及肺組織Sca-1表達(dá)的抑制作用，而發(fā)揮對肺氣腫動物模型肺功能和肺組織形態(tài)學(xué)的保護(hù)作用。③表觀遺傳學(xué)DNA甲基化機(jī)制參與了肺氣腫的發(fā)病機(jī)制。
　　第二章：5-雜氮-2'-脫氧胞苷對香煙提取物所致內(nèi)皮祖細(xì)胞功能及其干細(xì)胞抗原-

10、1表達(dá)的影響。
　　目的：觀察干細(xì)胞抗原-1(Stem Cell Antigen-1，Sca-1)在正常小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)上的表達(dá)，以及5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，AZA)對香煙提取物(Cigarette Smoking Extract，CSE)所致EPCs功能及其Sca-1蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：采用密度梯度離

11、心法分離小鼠骨髓EPCs并培養(yǎng);通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、對培養(yǎng)第7天的貼壁細(xì)胞行DiI-acLDL攝取及FITC-UEA-I結(jié)合雙染鑒定及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物，綜合鑒定EPCs;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測EPCs上Sca-1的表達(dá)。采用不同濃度和不同干預(yù)時間，用CSE溶液、AZA溶液體外干預(yù)培養(yǎng)7天的小鼠EPCs，采用噻唑藍(lán)比色法（MTT法）檢測EPCs增殖能力，選擇最佳干預(yù)濃度和干預(yù)時間進(jìn)行后續(xù)干預(yù)試驗。采用貼壁細(xì)胞計數(shù)檢測EPCs粘

12、附能力，培養(yǎng)液中NO濃度測定檢測EPCs分泌能力。將培養(yǎng)第7天的EPCs分為四組:正常EPCs組（對照組，N組），2umol/L AZA干預(yù)組（A組），1％CSE+2umol/L AZA干預(yù)組（AC組）和1％CSE干預(yù)組（C組），采用western-blot檢測各組Sca-1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴培養(yǎng)7天的EPCs呈梭形、紡錘形或多邊形，可形成首尾相連網(wǎng)狀血管樣結(jié)構(gòu)，亦可呈鋪路石樣外觀。其DiI-acLDL攝取及FITC-UEA

13、-I結(jié)合雙染陽性率為（94.67±4.16）％，其特異性表面抗原FITC-CD34、PE-CD133、APC-Flk-1三陽表達(dá)率為(95.07±1.73)％，加上PerCP-Sca-1后的四陽表達(dá)率(94.00±1.67)％，其中EPCs的Sca-1陽性表達(dá)率為(98.87±0.24)％。⑵(i)不同濃度和不同時間CSE干預(yù)后EPCs增殖能力比較:CSE干預(yù)3小時，與對照組比較，1％CSE和2.5％CSE組細(xì)胞OD值顯著增加(P＜0.

14、05)，5％CSE和10％CSE組細(xì)胞OD值顯著下降（P＜0.01）;CSE干預(yù)6小時，與對照組比較，1％CSE組細(xì)胞OD值顯著增加(P＜0.05)，2.5％CSE、5％CSE和10％CSE組細(xì)胞OD值顯著下降(P＜0.01);CSE干預(yù)24小時，與對照組比較，各CSE濃度干預(yù)均使細(xì)胞OD值下降（P＜0.01）。(ii)選擇1％CSE和干預(yù)24小時時間點，比較不同濃度5-azaC干預(yù)后的EPCs增殖能力:與對照組比較，1％CSE組，1％

15、CSE+2umol/L AZA組，1％CSE+5umol/LAZA組細(xì)胞OD值均下降(P＜0.05);與1％CSE組比較，1％CSE+2umol/LAZA組，1％CSE+5umol/LAZA組細(xì)胞OD值增加(P＜0.05);1％CSE+2umol/LAZA組，1％CSE+5umol/LAZA組細(xì)胞OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(iii)選擇1％CSE+2umol/LAZA和干預(yù)24小時時間點，比較各組EPCs粘附能力和分泌能力

16、:對照組（N組）、1％CSE+2umol/L AZA組（AC組）和1％CSE組(C組)，EPCs貼壁細(xì)胞計數(shù)比較為:與N組比較，AC組和C組貼壁細(xì)胞數(shù)顯著降低(P＜0.01)，與AC組比較，C組貼壁細(xì)胞數(shù)顯著降低(P＜0.01)。對照組（N組）、1％CSE+2umol/L AZA組（AC組）和1％CSE組（C組），EPCs培養(yǎng)液中NO濃度比較為:與N組比較，AC組和C組濃度顯著降低(P＜0.01)，AC組和C組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.

17、05)。⑶正常EPCs組（對照組，N組），2umol/L AZA干預(yù)組(A組)，1％CSE+2umol/L AZA干預(yù)組（AC組）和1％CSE干預(yù)組(C組)4組EPCs上Sca-1蛋白表達(dá)比較:與N組比較，C組Sca-1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），AC組及A組Sca-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與C組比較，N組，AC組，A組Sea-1蛋白表達(dá)均顯著上升(P＜0.01);AC組和A組之間Sca-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)

18、意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：①小鼠EPCs高表達(dá)Sea-1基因。②短時間低濃度的CSE干預(yù)使得EPCs的增殖功能代償性增強(qiáng)，延長干預(yù)時間和/或提高干預(yù)濃度都將使EPCs的功能降低，甚至完全抑制，呈時間和濃度依賴。③DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑能部分逆轉(zhuǎn)CSE對EPCs上Sea-1蛋白表達(dá)的抑制作用，同時改善EPCs的功能， EPCs上Sca-1蛋白表達(dá)和EPCs功能改變趨勢一致，提示DNA甲基化參與了EPCs功能受損機(jī)制，Sca