檢測肺孢子菌巢式PCR的建立及呼吸道疾病發(fā)作期患者肺孢子菌基因攜帶率研究.pdf

1、目的
　　建立檢測肺孢子菌基因的特異性mtLSU巢式PCR方法，研究其在實驗動物肺孢子感染模型的檢測效果及其敏感性和特異性，探討此方法應(yīng)用于早期診斷肺孢子菌肺炎(Pneumocystispneumonia，PCP)的可行性。將此方法應(yīng)用于臨床呼吸疾病急性發(fā)作期患者標本的肺孢子菌基因檢測，調(diào)查呼吸系統(tǒng)疾病急性發(fā)作期患者肺孢子菌定植或感染狀況，探討肺孢子菌感染與呼吸系統(tǒng)疾病的相關(guān)性。
　　方法
　　依據(jù)肺孢子菌線粒體大亞基

2、保守序列設(shè)計巢式PCR內(nèi)、外引物，建立并優(yōu)化檢測肺孢子基因的巢式PCR反應(yīng)體系。以免疫抑制誘導肺孢子菌感染大鼠模型為檢測對象，對比研究mtLSU巢式PCR與環(huán)六亞甲基四胺銀(GomoriMethenamineSilver，GMS)染色法檢測肺孢子菌的檢出率及陽性符合率。對陽性標本進行DNA純化，構(gòu)建分子克隆，采用倍比稀釋法研究mtLSU巢式PCR檢測敏感性;以呼吸道感染常見的8種病原體（光滑假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、

3、白色念珠菌、克柔假絲酵母菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體）為對照，檢測其特異性。利用新建立的巢式PCR檢測呼吸系統(tǒng)疾病急性發(fā)作期患者痰液中肺孢子菌基因，分析肺孢子菌在呼吸系統(tǒng)疾病患者中的定植率。
　　結(jié)果
　　肺印片GMS染色鏡檢實驗組大鼠，14只檢測到肺孢子菌包囊，檢出率為70％(14/20)，對照組檢出率為0(0/20)。用mtLSU巢式PCR均能檢測到實驗組大鼠肺孢子菌基因，陽性率為100％(20/20)，

4、與GMS染色法陽性率70.0％(14/20)比較差異有統(tǒng)計學意義(x2=4.17，P＜0.05)，對照組均為陰性，與GMS染色的陽性符合率為100％。敏感性檢驗結(jié)果表明，mtLSU巢式PCR擴增的最小量為366fg的肺孢子菌基因。特異性檢驗，其它8種呼吸道常見病原體的mtLSU巢式PCR的擴增結(jié)果均為陰性。測序結(jié)果顯示，新建立的mtLSU巢式PCR擴增的肺孢子菌基因序列與GeneBank中人源肺孢子菌基因序列同源性為100％。對98例呼