軀體感覺系統(tǒng)年齡相關性髓鞘病變及其在老年痛發(fā)病中的意義.pdf

1、研究背景：
　　世界發(fā)達國家和新的經(jīng)濟增長體國家（如我國）都存在人口老齡化問題，老齡人群的快速增長已經(jīng)為社會醫(yī)療和公共衛(wèi)生服務帶來了巨大挑戰(zhàn)。無法回避的事實是相當比例的老年人正在經(jīng)歷著各種類型的疼痛。據(jù)調(diào)查，養(yǎng)老院里高達80％的老年人存在至少一項疼痛問題，超過40%的人正在經(jīng)歷難以忍受的疼痛。而老齡化過程本身也是各種類型疼痛的主要易感因素。研究顯示，有些慢性痛的發(fā)病率隨增齡而提高，如難治的頑固性外周神經(jīng)病理性痛（帶狀皰疹后神經(jīng)痛、

2、糖尿病性神經(jīng)痛）、中樞神經(jīng)病理性痛（如中樞中風后疼痛）和痛性骨關節(jié)變性病等多發(fā)生在老年人，而青年人少見，提示老年痛具有特殊的生物學機制，但機制至今不清。最近我們實驗室在新生、成熟和老化10幾個年齡大鼠的研究上發(fā)現(xiàn)，無論在外周神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）還是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS），粗大的有髓神經(jīng)纖維都最早出現(xiàn)變性樣改變，我們把這個現(xiàn)象叫做髓鞘病變（myelinopathy）。髓鞘病變組織病理上可被分為 I-III級，I級只累及髓鞘本身（如致密層解

3、開、空泡、崩解、斷裂），而 III級可累及軸突并導致其發(fā)生顯著的變性。本博士學位論文在以往研究的基礎上，重點觀察和分析了軀體感覺初級傳入神經(jīng)元的外周突（如坐骨神經(jīng)）和中樞突（脊髓后索）老化的年齡變化特點，然后探索髓鞘病變對脊髓背角（疼痛信息處理與加工的門戶）的影響，期望從髓鞘病變的分子和細胞機制上找到老年痛發(fā)生的身體易感因素。
　　研究目的：
　　1.觀察大鼠軀體感覺系統(tǒng)外周和中樞神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的年齡相關性變化；
　

4、　2.檢測大鼠脊髓神經(jīng)纖維髓鞘相關蛋白表達水平的年齡相關性變化；
　　3.檢測大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的年齡相關性活化狀態(tài)；
　　4.評價大鼠年齡對軀體感覺、軀體運動和模型大鼠痛行為的影響；
　　5.探討大鼠軀體感覺系統(tǒng)神經(jīng)纖維老化變性的可能分子機制。
　　研究意義：
　　應用電鏡、免疫熒光等形態(tài)學方法，結(jié)合分子生物學技術和行為學手段，從軀體感覺系統(tǒng)神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)的年齡相關性改變、膠質(zhì)細胞年齡相關

5、性活化、正常大鼠及神經(jīng)病理性痛模型大鼠年齡相關性痛行為變化和炎性因子在老化過程中的動態(tài)改變等多個方面去探討老年痛的可能機制。希望能夠從老化相關髓鞘病變的發(fā)生發(fā)展中尋找老年痛發(fā)生的生物學風險因素。
　　實驗方法：
　　本課題應用透射電鏡技術觀察大鼠軀體感覺系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)的年齡相關性變化；應用免疫學方法（免疫熒光和免疫印跡）檢測大鼠脊髓中髓鞘相關蛋白表達水平的年齡相關性變化和大鼠脊髓內(nèi)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的年齡相關性活化狀態(tài)；

6、應用行為學手段評價大鼠軀體感覺、軀體運動的年齡相關性改變及年齡對疼痛模型大鼠痛行為的影響。最后為了探討大鼠年齡相關性軀體感覺、軀體運動改變的可能機制，我們應用免疫標記和免疫印跡的方法檢測不同年齡大鼠 HMGB1及其受體RAGE的表達水平。
　　實驗結(jié)果：
　　1.大鼠軀體感覺系統(tǒng)神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的年齡相關性變化
　　大鼠軀體感覺系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出顯著的年齡相關性改變。生后2月齡大鼠坐骨神經(jīng)和脊髓后索有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)基本

7、完整，且基質(zhì)結(jié)構(gòu)電子密度均勻。而12月齡時，其中部分有髓神經(jīng)纖維發(fā)生了髓鞘病變。生后26月齡時，有髓神經(jīng)纖維的病變更加明顯，絕大部分髓鞘都出現(xiàn)了腫塊形成、異源性物質(zhì)沉積、髓鞘冗余、施-蘭切跡崩解、內(nèi)向或/和外向髓鞘褶皺、軸索擠壓變形等。最終累及軸突發(fā)生退行性改變（軸突變性）。此外，老齡時期，基質(zhì)成分丟失顯著，纖維間距離增大。坐骨神經(jīng)中無髓神經(jīng)纖維也發(fā)生了年齡相關性的病理改變。生后2個月大鼠坐骨神經(jīng)無髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)完整，呈現(xiàn)由施旺細胞單層

8、突起包裹的數(shù)根纖維為一組的神經(jīng)束狀結(jié)構(gòu)，而12月齡時，個別軸突中出現(xiàn)空泡樣變性，但還未累及施旺細胞。26月齡時，病理變化加劇，束內(nèi)的無髓纖維膜結(jié)構(gòu)破壞嚴重，單根纖維結(jié)構(gòu)不清，軸突內(nèi)有空泡，電子致密度異常增高。此月齡，施旺細胞發(fā)生變性壞死，進而其包繞的無髓纖維發(fā)生整束的壞死，呈現(xiàn)“黑葡萄樣”結(jié)構(gòu)。脊髓后索是粗大的初級傳入有髓纖維進入后形成的上行纖維束路，觀察顯示其存在與外周同樣的病理改變，少突膠質(zhì)細胞也出現(xiàn)變性樣改變。為了更好的對髓鞘結(jié)構(gòu)

9、的年齡相關性變化進行定量分析，我們使用本實驗室提出的病理分級方法，對神經(jīng)纖維病變進行分級定量。結(jié)果提示，坐骨神經(jīng)中病變的有髓神經(jīng)纖維和無髓神經(jīng)纖維所占比例均隨年齡增長顯著增加；脊髓后索中病變的有髓神經(jīng)纖維所占比例隨年齡增長顯著增加。
　　2.大鼠脊髓中樞髓鞘相關蛋白表達水平的年齡相關性變化
　　大鼠脊髓中樞髓鞘相關蛋白表達水平呈現(xiàn)顯著的年齡相關性改變。2月齡大鼠脊髓后索髓鞘相關蛋白（O1、CNP、GalC、MOG等）依髓鞘結(jié)

10、構(gòu)呈現(xiàn)出完整的圓環(huán)狀。DAPI染色顯示后索內(nèi)細胞胞核均勻、散在分布。而老齡時期，髓鞘相關蛋白含量顯著下降，特別是MOG、CNP和GalC，DAPI陽性細胞核密度減少明顯，并出現(xiàn)了細胞核聚集的現(xiàn)象。對脊髓細胞骨架分子進行標記，結(jié)果顯示NF200的含量在老齡大鼠后索有小幅度的減少。用 MBP和NF200雙標顯示，少突膠質(zhì)細胞的突起穿行于神經(jīng)纖維之間形成髓鞘，但老齡時的一個顯著特征是在MBP和NF200共標記的纖維周圍?？梢娒芗男≈睆郊毎?/p>

11、聚集，而聚集細胞中DAPI與MBP基本不共存，提示是非髓鞘形成細胞的核聚集所致。后續(xù)鑒定顯示，聚集的細胞核與GFAP不共存，但與Iba1有共存現(xiàn)象，提示聚集細胞是小膠質(zhì)細胞。對脊髓背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細胞進行分類標記，結(jié)果顯示無論是DRG大細胞，亦或是中小細胞均未隨年齡的增長發(fā)生數(shù)量上的改變。而對皮膚神經(jīng)纖維標記后發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)纖維數(shù)量在中、老齡大鼠皮膚顯著下降。同時，我們也檢測了坐骨神經(jīng)中髓鞘相關蛋白的表達情況。結(jié)果提示坐骨神經(jīng)中CNP、

12、PMP22和MBP的蛋白表達水平隨年齡增長顯著下降；老齡時期細胞骨架標記物（NF200）的表達水平也明顯的下降。
　　3.大鼠脊髓中樞小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的年齡相關性活化狀態(tài)
　　大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞發(fā)生了年齡相關性的活化增強。青齡大鼠脊髓中Iba1陽性細胞很少，而在老齡時期，Iba1陽性細胞大量增加，小膠質(zhì)細胞活化明顯。與白質(zhì)區(qū)域（后索）相比，老齡大鼠灰質(zhì)內(nèi)（背角）小膠質(zhì)細胞活化更為顯著。后索中Iba1陽性

13、細胞密度老齡較青齡增加了約2倍，而在背角中，增加幅度接近4倍之多。且老化時，被激活的小膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出胞體和突起變大。與小膠質(zhì)細胞相似，老齡時期星形膠質(zhì)細胞活化明顯，但分布灰、白質(zhì)間無明顯差別。
　　4.大鼠年齡對軀體感覺、軀體運動和疼痛反應行為的影響
　　我們分別利用PWMT、PWTL評價大鼠軀體感覺變化，利用Rot-Rod評價軀體運動功能年齡相關性改變。結(jié)果提示老齡動物（26月齡）械痛敏閾值顯著升高、熱痛敏潛伏期顯著延長。

14、軀體運動功能評價結(jié)果與軀體感覺類似，老齡時期，大鼠運動功能發(fā)生顯著下降，在Rot-Rod上停留時間降低了幾十倍。但當評價年齡對不同疼痛模型大鼠痛行為影響時發(fā)現(xiàn)，無論是炎性痛模型還是神經(jīng)損傷痛模型，老齡大鼠痛時程顯著延長。綜合上述，提示老齡大鼠熱和機械痛閾均提高（對痛遲鈍），但炎性痛和神經(jīng)病理性痛更易持續(xù)慢性化。
　　5.老齡大鼠軀體感覺系統(tǒng)髓鞘病變的可能分子機制探索
　　在前述結(jié)果的基礎上，我們認為神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘和軸索發(fā)生崩解

15、破壞后產(chǎn)生的物質(zhì)會激活小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，產(chǎn)生免疫學反應，惡化原有損傷，引起一系列痛行為。因此檢測了晚期炎癥因子 HMGB1及其受體表達的年齡相關性變化。結(jié)果提示，HMGB1及其受體 RAGE在中、老齡動物脊髓后索、背角中顯著高表達。與其高表達同時發(fā)生的還有膠質(zhì)細胞的大量活化。與中樞神經(jīng)系統(tǒng)類似，HMGB1在坐骨神經(jīng)中的表達也具有年齡相關性，老齡時期顯著增高3倍以上。RAGE在老齡時期的表達也增高了約20%。
　　結(jié)論：

16、r>　　1.髓鞘結(jié)構(gòu)的病理改變具有年齡相關性，隨年齡增長其破壞程度不斷加重。提示在老化過程中，神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘可能是最易受累的組織結(jié)構(gòu)，同時也可能是最主要的老化作用靶點。
　　2.髓鞘相關蛋白在老齡時期顯著表達下調(diào)，使得髓鞘板層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性遭到破壞，這可能是髓鞘結(jié)構(gòu)出現(xiàn)年齡相關性病理改變的物質(zhì)基礎。
　　3.正常大鼠老齡化過程伴隨機械痛刺激閾值升高和熱痛刺激潛伏期顯著延長，提示痛敏感性降低，但老齡化可以延長痛反應的時程，提示老

17、齡大鼠疼痛更易持續(xù)慢性化。
　　4.小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞在老化時均出現(xiàn)活化增強，且在出現(xiàn)退行性改變的髓鞘旁有小膠質(zhì)細胞的聚集。膠質(zhì)細胞的激活會誘發(fā)一系列炎性反應，導致脊髓處于一種敏化狀態(tài)，這可能是導致疼痛慢性化的重要機制之一。
　　5.老化過程中脊髓后索及背角中 HMGB1及其受體 RAGE表達大量增加，這可能是導致膠質(zhì)細胞活化的重要分子機制。
　　6.老齡動物外周皮膚神經(jīng)纖維終末(PGP9.5)和熱傷害性感受器(