ERS在腺苷誘導(dǎo)的心肌保護(hù)中的作用及其機(jī)制.pdf

1、隨著溶栓療法、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等治療方法廣泛應(yīng)用于臨床，急性心肌梗死的治療也進(jìn)入了再灌注時(shí)代。但臨床治療發(fā)現(xiàn)心肌在較長(zhǎng)時(shí)間缺血造成損傷后，再次恢復(fù)供血不但不減輕或逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞損傷，反而出現(xiàn)細(xì)胞損傷加重現(xiàn)象，出現(xiàn)心肌頓抑、心律失常、心肌細(xì)胞壞死等再灌注損傷問題。因此，如何減輕再灌注損傷（ischemia reperfusion inju

2、ry，IRI），最大限度保護(hù)缺血心肌，對(duì)于挽救瀕死心肌，改善預(yù)后具有重要的臨床意義。
　　近年來，不同的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腺苷及其受體激動(dòng)劑均具有對(duì)缺血/再灌注損傷心肌的保護(hù)效應(yīng)，并且其保護(hù)效應(yīng)可被腺苷受體抑制劑所抑制。腺苷作為機(jī)體能量代謝的產(chǎn)物主要源于ATP降解。研究報(bào)道心臟短暫缺血后可引起大量ATP降解，導(dǎo)致局部心肌組織腺苷積聚。腺苷可以觸發(fā)或介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning)，減輕再灌注損傷，

3、在缺血預(yù)處理中起著非常重要的作用，腺苷作為內(nèi)源性活性物質(zhì)，不僅主導(dǎo)了早期保護(hù)機(jī)制，而且在延時(shí)保護(hù)時(shí)也發(fā)揮了重要作用。腺苷受體目前發(fā)現(xiàn)至少有4種，即A1、A2a、A2b和A3受體[2]，其中A2受體可能在后處理心肌保護(hù)效應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。最近的研究表明，一些腺苷擬似劑可選擇性地通過A2受體發(fā)揮心臟保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。
　　Hausenloy等人提出抗心肌IRI信號(hào)通路的最終步驟是抑制粒體膜通透性轉(zhuǎn)移孔（mito

4、chondrial-permeability transition pore，mPTP）的開放，而具有抑制mPTP開放作用的藥物，可以減輕心肌IRI，抑制mPTP的開放是許多心臟保護(hù)物質(zhì)抗IRI的共同機(jī)制。糖原合成激酶3β（GSK-3β）是一個(gè)多功能的絲氨酸/蘇氨酸類激酶，在體內(nèi)具有非常重要的生物學(xué)功能。研究證明，GSK-3β是許多心肌保護(hù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同作用靶點(diǎn)，抑制GSK-3β的活性可阻止mPTP的開放，進(jìn)而減輕心肌IRI。

5、>　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）指細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境的改變，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白質(zhì)的聚集、鈣穩(wěn)態(tài)破壞、生理功能紊亂的一種亞細(xì)胞器的病理過程。ERS是應(yīng)激時(shí)發(fā)生在細(xì)胞中的最初反應(yīng)，可進(jìn)一步介導(dǎo)線粒體應(yīng)激和核應(yīng)激，近年來其在IRI的作用也在很多實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated protein，GRP78、GRP94)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的伴侶蛋白，被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

6、的標(biāo)志物。Martindale等人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)新生小鼠心肌細(xì)胞在體外經(jīng)缺血再灌注處理后，ERS誘導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)的標(biāo)志物GRP78和GRP94的表達(dá)水平升高，提示缺血再灌注誘導(dǎo)了ERS反應(yīng)。Zhang等人在體外大鼠心臟缺血再灌注模型上，發(fā)現(xiàn)Ghrelin能通過抑制ERS保護(hù)IRI導(dǎo)致的心肌損害。然而，腺苷及其受體的心臟保護(hù)作用是否通過ERS途徑尚不清楚。
　　目的：探討NECA是否通過減輕ERS使GSK-3?失活，進(jìn)而阻止m

7、PTP的開放并保護(hù)缺血/再灌注心肌。
　　方法：實(shí)驗(yàn)一研究對(duì)象選用大鼠胚胎心臟組織來源的H9c2細(xì)胞株。用800μM H2O2處理H9c2細(xì)胞，造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。熒光染色使用四甲基羅丹明乙酯（tetramethyrhodamine ester，TMRE），應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)，以543nm的氬離子激發(fā)光采集圖像，觀察細(xì)胞TMRE熒光及給予相應(yīng)處理后熒光的變化，測(cè)定H9c2細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial

8、membrane potential,?Ψm）的改變，以此判斷mPTP的開放程度也即線粒體的損傷程度。通過免疫熒光法及Western blot法，檢測(cè)GSK-3β（Ser9）的磷酸化、血管擴(kuò)張刺激磷蛋白（Vasodilator stimulated phosphoprotion,VASP）（Ser239）、GRP94的改變。探討腺苷A2受體激動(dòng)劑（5'-N-ethylcarbo-xamidoad-enosine，NECA）是否通過抑制

9、ERS使 GSK-3β失活，進(jìn)而阻止 mPTP的開放而發(fā)揮其心臟保護(hù)作用，探討NECA使GSK-3β失活的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)二選用雄性Wistar大鼠，體重為250-300 g，利用心臟Langendorff灌流裝置及結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的方法，制備大鼠離體心臟灌流模型。將大鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組（缺血/再灌注（I/R）組）、NECA組（I/R+ NECA）、TUDCA（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑）組（I/R+TUDCA），分別在灌流液中

10、加入NECA或TUDCA，于再灌注10、30、60、120 min時(shí)從缺血區(qū)采集心臟組織標(biāo)本。用TTC法測(cè)定心肌梗死面積，以確定NECA的心臟保護(hù)作用。用Western blot法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP94的表達(dá)及GSK3β的磷酸化程度。用透射電鏡觀察心臟缺血/再灌注及給藥后心肌超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一
　?、偌す夤簿劢癸@微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，H9c2細(xì)胞經(jīng)H2O2（800μM）處理20 min后，測(cè)

11、得TMRE熒光強(qiáng)度明顯降低（36.7±3.7％）。與H2O2對(duì)照組相比，使用不同濃度的NECA（0.01μM-10μM）處理細(xì)胞，均能夠抑制TMRE熒光強(qiáng)度的降低，其中0.1μM NECA效果最為明顯（81.0±1.1%），提示NECA抑制氧化應(yīng)激引起的mPTP的開放。
　?、赪estern blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（97.1±1.3%）、（123.8±4.6%），不同濃度的NECA（0.01μM-10μM）均能增加 GSK

12、-3β（Ser9）的磷酸化，同時(shí)降低GRP94的表達(dá)，其中0.1μM NECA效果最為明顯（139.4±5.2%）、（55.7±1.5%），提示NECA可以使GSK-3β失活，ERS可能參與了NECA的心肌保護(hù)作用。
　　③Western blot結(jié)果顯示，NECA（0.1μM）促進(jìn)GSK-3β（Ser9）磷酸化的作用被PKG抑制劑KT5823（0.1μM）阻斷，提示NECA可能通過cGMP- PKG信號(hào)通路調(diào)節(jié)GSK-3β（Se

13、r9）的磷酸化而發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。與對(duì)照組相比（102.1±2.1%）、（101.4±4.2％），NECA（0.1μM）使 VASP（Ser239）的磷酸化明顯增多（158.2±2.6%），同時(shí)使 GRP94的表達(dá)明顯降低（98.7±2.2%），此作用可被KT5823（0.1μM）所抑制(126.2±2.2%)、（119.6±2.1%），表明NECA可能通過ERS和cGMP/PKG信號(hào)通路，使GSK-3β失活而發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。

14、r>　?、躓estern blot結(jié)果顯示，NECA（0.1μM）促進(jìn)GSK-3β（Ser9）磷酸化的作用被ERS誘導(dǎo)劑2-DG（20 mM）所阻斷；與對(duì)照組相比（101.6±3.9%）（116.2±3.3％），NECA（0.1μM）使GSK-3β（Ser9）的磷酸化明顯增多（159.7±15.0%），同時(shí)使GRP94的表達(dá)明顯降低（60.5±2.6%），此作用可被2-DG（20 mM）所抑制（123.5±9.1%）、（101.2±3.

15、4%）。進(jìn)一步提示NECA可能通過減輕ERS而調(diào)節(jié)GSK-3β（Ser9）的磷酸化，從而發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。
　?、軼estern blot結(jié)果顯示，對(duì)照組相比，H2O2處理細(xì)胞導(dǎo)致GSK-3β蛋白的磷酸化水平顯著降低，同時(shí)使GRP94的表達(dá)明顯增加，而這一作用被NECA（0.1μM）所阻斷，表明NECA通過防止氧化應(yīng)激引起的GSK-3β活化及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生而發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)二
　?、倥c缺血/再灌注組（

16、I/R）（46.8±5.5%）相比，NECA和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDCA使心肌梗死面積（26.5±4.9%）（36.0±5.1%）減小，提示ERS參與NECA的心肌保護(hù)作用。
　　②Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（97.1±1.3%）、（123.8±4.6%），NECA（0.1μM）和TUDCA均能抑制再灌注期GRP94的表達(dá)，增加GSK-3β的磷酸化，提示NECA可能通過抑制GSK-3β的活性和ERS的發(fā)生而保護(hù)