關(guān)于RAGE-配體系統(tǒng)在慢性間歇性低氧致動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制中的作用的初期體外研究.pdf

1、目的：
　　阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的重要原因之一，但關(guān)于其具體作用機(jī)制目前尚未闡明。而OSAHS的典型病理特征表現(xiàn)為慢性間歇性低氧（IH），其可能是OSAHS導(dǎo)致AS的關(guān)鍵因素。多項(xiàng)研究指出，RAGE-配體系統(tǒng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用，而IH能夠激活A(yù)GEs/RAGE系統(tǒng)。因此，本研究擬基于RAGE-配體系統(tǒng)，探討慢性IH導(dǎo)致AS的相關(guān)機(jī)制。首先，在體外實(shí)驗(yàn)中，使

2、用RNAi沉默目的基因RAGE，檢測(cè)IH對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、泡沫細(xì)胞的形成及膽固醇運(yùn)輸?shù)鞍椎恼{(diào)節(jié)等方面的影響。實(shí)驗(yàn)初期主要完成如下兩項(xiàng)：一是通過優(yōu)化PMA誘導(dǎo)分化THP-1細(xì)胞的條件，成功誘導(dǎo)出THP-1源性巨噬細(xì)胞，建立巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用于后續(xù)AS致病機(jī)制的觀察。二是構(gòu)建并篩選出最佳shRNA/RAGE慢病毒載體并感染THP-1細(xì)胞，以期到達(dá)沉默THP-1細(xì)胞RAGE基因效果，便于用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組。
　　方法：

3、r>　　體外培養(yǎng)THP-1細(xì)胞；PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為THP-1源性巨噬細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD14、CD68陽性率，鑒定其誘導(dǎo)分化程度；構(gòu)建shRNA/RAGE慢病毒載體；shRNA/RAGE慢病毒載體感染THP-1細(xì)胞，RTQ-PCR及Western-blot鑒定RAGE在THP-1細(xì)胞中的沉默情況；
　　結(jié)果：
　　1、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞表面標(biāo)記物CD14、CD68的百分率，誘導(dǎo)前分

4、別為3.5％、1.3%，誘導(dǎo)后表面標(biāo)志物明顯升高，分別為37.7%、46.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示成功誘導(dǎo)出THP-1源性巨噬細(xì)胞。
　　2、成功構(gòu)建shRNA/RAGE慢病毒載體，RT-PCR結(jié)果顯示，KD1、KD2、KD3組shRNA/RAGE慢病毒載體對(duì)RAGE基因的抑制效果均不明顯，抑制率分別為47.8%、30.2%與29.4%；Western-blot結(jié)果顯示，KD1、KD2、KD3組慢病毒載

5、體對(duì)RAGE蛋白表達(dá)抑制效果不佳，抑制率分別為41.2%、14.9%與11。3%，提示KD1、KD2、KD3組shRNA/RAGE慢病毒載體均未能成功產(chǎn)生基因沉默效果，不可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，需重新設(shè)計(jì)shRNA/RAGE慢病毒載體或者使用其他方法阻斷RAGE—配體信號(hào)通路。
　　結(jié)論：
　　1、PMA成功誘導(dǎo)出THP-1源性巨噬細(xì)胞，成功建立巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　2、成功構(gòu)建了shRNA/RAGE慢病毒載體，KD1、KD