間歇低氧狀態(tài)動脈粥樣硬化發(fā)生的基因表達譜研究.pdf

1、背景：阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合癥(obstructive sleep apnea/hypopeasyndrome，OSAHS)是具有一定潛在危險的疾病，它對機體的影響復雜而廣泛，除直接的呼吸系統(tǒng)損害外，尚可導致心腦血管疾病。間歇低氧(Intermittenthypoxia，IH)是OSAHS所具有的、獨特方式的低氧，其特點是：反復發(fā)生的低氧間期在20～120秒間、兩次低氧間期血氧回到正常水平，這種缺氧/再氧合可能會出現(xiàn)某些類似于缺血

2、/再灌注過程中所出現(xiàn)的病理改變。研究表明，間歇低氧不同于持續(xù)低氧，IH可能啟動了與持續(xù)低氧不同的細胞內(nèi)信號傳導機制，導致機體產(chǎn)生多方位的損害。新近研究也表明，IH較易累及心血管系統(tǒng)誘發(fā)多種高危并發(fā)癥的發(fā)生，是心腦血管疾病發(fā)生的潛在的重要獨立危險因素，OSAHS患者與動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)病率密切相關(guān)，究竟OSAHS的m作用機制是否影響AS的形成目前并不清楚。 目的： 模擬人類OSAHS間

3、歇低氧狀態(tài)建立AS形成的動物模型，探討間歇低氧狀態(tài)對AS形成的影響。應用基因芯片技術(shù)篩選腹主動脈粥樣硬化形成的差異表達基因和構(gòu)建高脂間歇低氧兔肝抑制差減cDNA文庫，研究篩選間歇低氧狀態(tài)下AS形成過程中肝臟的相關(guān)基因的差異表達變化，探討IH狀態(tài)下AS形成的可能分子機制，為AS干預治療提供理論基礎(chǔ)。 方法： 選用健康實驗兔24只，雌、雄性各半，2～4個月齡。根據(jù)基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)、高脂飼料(high fat diet，HFD)喂

4、養(yǎng)、間歇低氧干預條件，將24只實驗兔隨機分4組。IH組6只(基礎(chǔ)飼料+間歇低氧)、HFD組6只(高脂飼料)、HFD+IH組6只(高脂飼料+間歇低氧)、C組6只(基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)作為對照)。適應性喂養(yǎng)標準基礎(chǔ)飼料1周后，實驗兔稱重，并從每只實驗兔耳緣靜脈取空腹血2ml測定血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(low density lipoprotein-c

5、holesterol，LDL-C)。 動物造模實驗期間，每天9:00Am～5:00PM將IH組、HFD+IH組實驗兔置于間歇低氧艙內(nèi)。通過控氧儀監(jiān)測間歇低氧艙內(nèi)的氧濃度來程控輸氣和排氣。向間歇低氧艙內(nèi)循環(huán)充入氮氣(N2)和空氣混合氣體(90％N2和10％O2)，在電路控制下分別以2L/min的流速輸入，每次循環(huán)8分鐘，即4分鐘充入氮氣，維持艙內(nèi)氧氣最低濃度達8.5％，維持時間1分鐘，隨后2分鐘排出艙內(nèi)混合空氣，使艙內(nèi)氧濃度恢復到

6、21％維持1分鐘，至下-循環(huán)，以此條件控制間歇低氧狀態(tài)。每天除實驗時間外，C組、m組、HFD組、HFD+IH組實驗兔生活環(huán)境均相同。12周后，處死實驗兔，從主動脈起始部至腹主動脈分叉處全程解剖暴露，觀察其主動脈粥樣硬化情況，分別剪取各組實驗兔主動脈，甲醛固定制成石蠟切片，用于HE染色和蘇丹Ⅲ染色。另一部分迅速凍存于液氮罐中，-70℃超低溫冰箱備用。同時，觀察腹主動脈、心、肝臟、肺等器官病理組織學改變。 提取HFD組、HFD+IH

7、組、IH組實驗兔腹主動脈總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備雜交探針，與采用美國Affymetrix公司Human Cardiovascular Disease Gene Array Ⅱ(HS-038)芯片雜交，雜交信號經(jīng)SeanArray4000S掃描后用Microarray Suite Version 5.0軟件分析。采用RT-PCR方法驗證部分差異表達基因。 提取HFD組和HFD+HH組肝臟mRNA，巢式PCR擴增合成雙鏈eDNA(dsc

8、DNA)，純化dscDNA，Rsal酶切dscDNA，將PCR產(chǎn)物與T/A載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行文庫擴增，挑選陽性克隆進行PCR擴增鑒定。取陽性克隆抽提質(zhì)粒用于模板進行PCR擴增。在經(jīng)過兩輪差減雜交和兩次抑制性PCR得到兩者之間差異表達的cDNA。用a-32p標記的PFD組、PFD+IH組eDNA為探針，分別與相同的用陽性克隆PCR產(chǎn)物制備好的雜交膜進行反向Northern Dot Blot雜交，放射性顯影，雜交信號經(jīng)掃描后，用S

9、eanAlyze軟件進行分析，對雜交信號存在2倍差距的克隆進行標記。挑取12個差異明顯的克隆進行測序，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性匹配分析。定量熒光PCR驗證實驗兔肝臟相關(guān)差異基因。 結(jié)論： 1.本實驗成功利用間歇低氧艙建立了IH狀態(tài)促進AS形成的實驗兔動物模型。IH是加重動脈粥樣斑塊形成的新的重要危險因素。 2.IH狀態(tài)下AS的發(fā)生發(fā)展涉及多個基因的改變。差異表達譜分析可能為動脈粥樣硬化發(fā)病機制研究提供

10、新的思路。 3.在IH狀態(tài)下，血管壁局部的炎癥反應合并血液的高凝和脂肪顆粒的沉積可能導致局部動脈粥樣斑塊的形成；間歇低氧介導有關(guān)基質(zhì)降解的相關(guān)調(diào)控基因參與了纖維膠原降解與細胞外基質(zhì)分解過程;間歇低氧可能導致彈性蛋白成熟必需的賴氨酸氧化酶、原纖維蛋白代謝等異常，導致硬化血管壁中多聚糖蛋白能阻礙膠原彈性蛋白聚合到彈性纖維上是其調(diào)控影響因素之一，IL-8、COX-2發(fā)揮了重要作用。 4.在IH狀態(tài)下肝細胞HDAC7的表達下調(diào)，